雙石清熱合劑指紋圖研究及5種成分含量測(cè)定

宋奇，王隆隆，楊忠杰，陳恒文，劉菊，黃霞，于曉濤*（.漯河市中心醫(yī)院，河南 漯河 600；.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 00000；.鄭州市中醫(yī)院，鄭州 50000；.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州 50000）

雙石清熱合劑（SQM）是以經(jīng)典名方“銀翹散”為基礎(chǔ)，在長(zhǎng)期臨床應(yīng)用中形成的臨床經(jīng)驗(yàn)方，全方由金銀花、黃芩、知母等14 味中藥組成。本方中金銀花清熱解毒、疏散風(fēng)熱，為君藥，黃芩、知母清熱燥濕、瀉火解毒、滋陰潤(rùn)燥，為臣藥，佐以梔子、大青葉等清瀉三焦火熱、涼血解毒，共奏清熱解毒之功。常用于肺胃實(shí)熱、口舌生瘡、牙齦腫痛及上呼吸道感染等癥。目前，雙石清熱合劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)比較簡(jiǎn)單，僅包含《中國(guó)藥典》2020年版合劑項(xiàng)下的鑒別項(xiàng)和檢查項(xiàng)，不能反映制劑的整體概貌及進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。

中藥制劑發(fā)展的難點(diǎn)在于中藥飲片的來(lái)源及批次不同對(duì)復(fù)方制劑中物質(zhì)基礎(chǔ)影響較大，不利于質(zhì)量控制[1-3]。指紋圖譜從“整體”上全面反映中藥飲片及制劑內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)的特征，可作為質(zhì)量控制研究的有效方法[4]。化學(xué)模式識(shí)別能夠?qū)χ讣y圖譜信息進(jìn)行數(shù)字化識(shí)別、處理和評(píng)估，已廣泛應(yīng)用于中藥飲片及制劑的質(zhì)量控制研究[5-8]。

本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立12 批雙石清熱合劑的指紋圖譜，通過(guò)相似度評(píng)價(jià)，結(jié)合聚類分析（CA）、主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）法篩選批次間差異貢獻(xiàn)較大的主要成分基礎(chǔ)，同時(shí)測(cè)定5 種成分的含量，從定性與定量?jī)煞矫妫瑸殡p石清熱合劑的質(zhì)量控制研究提供參考[9]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（日本島津LC-20AD 型，包括二元泵，全波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，工作站）；SB25-12D 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；AUW-120D 型十萬(wàn)分之一電子天平（日本Shimadzu 公司）；Milli-Q 超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）；5810R 高速離心機(jī)（美國(guó)Eppendorf 公司）。

1.2 試藥

SQM 樣品（S1 ～S12，醫(yī)院自制，批號(hào)分別為20191205、20200312、20200506、20200710、20200925、20201122、20201230、20210111、20210115、20210306、20210507、20210625）。綠原酸（批號(hào)：110753-201817，純度：96.8%）、梔子苷（批號(hào)：110749-201718，純度：97.6%）、芒果苷（批號(hào)：111607-201704，純度：98.1%）、黃芩苷（批號(hào)：110715-201821，純度：95.4%）、牛蒡苷（批號(hào)：110819-201812，純度：95.0%）、漢黃芩苷（批號(hào)：112002-201702，純度：98.5%）、黃芩素（批號(hào)：111514-201706，純度：98.9%）（對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher 公司），甲酸（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），水為飲用水或超純水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.05%甲酸-水（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0 ～17 min，7%B；17 ～28 min，7% ～13%B；28 ～32 min，13%B；32 ～37 min，13% ～17%B；37 ～42 min，17%B；42 ～48 min，17% ～23%B；48 ～63 min，23%B；63 ～75 min，23% ～48%B；75 ～95 min，48%B；95 ～96 min，48%～7%B；96 ～110 min，7%B）；柱溫40℃；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)239 nm[10-11]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密取綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷及黃芩素對(duì)照品適量，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為1.86、1.92、1.75、2.14、2.02、1.96、1.42 mg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密取各儲(chǔ)備液適量，混勻，制得含綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素分別為25.76、57.30、20.98、234.24、25.82、34.47、59.86 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液，密封保存。

2.2.2 供試品溶液制備 精密取 12 批SQM 各1 mL，加甲醇1 mL，超聲10 min，混勻，13 000 r·min－1離心，取上清液為供試品溶液。

2.2.3 單味飲片供試品溶液制備 參照SQM 制備工藝（10 倍量水，浸泡40 min，煎煮3 次，每次100 min），制備金銀花、黃芩、知母等14 味中藥的單味飲片溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備各單味飲片的供試品溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取SQM（S1）供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以黃芩苷為參照峰，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均≤1.0%，相對(duì)峰面積RSD均≤1.1%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取SQM（S1）樣品，平行制備供試品溶液6 份，進(jìn)樣測(cè)定，以黃芩苷為參照峰，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均≤1.0%，相對(duì)峰面積RSD均≤1.9%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取SQM（S1）供試品適量，分別在0、3、9、24、48 h 進(jìn)樣測(cè)定，以黃芩苷為參照峰，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均≤0.9%，相對(duì)峰面積的RSD均≤1.5%，表明供試品在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜研究

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備12 批SQM 供試品（S1 ～S12），進(jìn)樣測(cè)定，記錄各色譜圖。

2.4.1 參照峰的選定 在12 批SQM 供試品色譜圖中黃芩苷特征峰面積較大、分離度較高且保留時(shí)間適中，可作為參照峰。

2.4.2 相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積 計(jì)算12 批SQM 指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。結(jié)果各共有峰保留時(shí)間的RSD均小于1.1%，表明12 批樣品共有峰的出峰時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定；峰面積RSD相差較大，說(shuō)明SQM 存在批次間差異。

如圖3所示，漂燙溫度與切片厚度之間交互作用顯著，切片厚度和漂燙溫度分別為4 mm和90 ℃時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)化綜合得分達(dá)到最大值。當(dāng)切片厚度大于4 mm樣品厚度越大，內(nèi)部淀粉顆粒為糊化，使得產(chǎn)品破碎力增加，脆度降低。在一定漂燙溫度和時(shí)間下，樣品中引起褐變的為完全失活，有利于產(chǎn)品色澤的提高。

2.4.3 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 取S1 ～S12的SQM 樣品建立指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”計(jì)算相似度。結(jié)果，各SQM 譜圖與對(duì)照?qǐng)D譜相似度均大于0.97，共標(biāo)定22 個(gè)共有峰，占總峰面積的83.48%，可以代表色譜圖概況。以黃芩苷為參照峰，12 批SQM 供試品各共有峰保留時(shí)間的RSD均小于1.2%，峰面積RSD在7.11%～59.16%，相差較大，說(shuō)明SQM 批次間存在差異（見(jiàn)圖1 及表1）。

圖1 HPLC 指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜（R）Fig 1 HPLC fingerprint and control fingerprint （R）

表1 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 1 Similarity evaluation

2.4.4 共有峰化學(xué)成分指認(rèn) 取混合對(duì)照品液、SQM 供試品（S1）溶液及單味飲片供試品溶液、進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。通過(guò)混合對(duì)照品、SQM供試品（S1）及單味飲片色譜比較共指認(rèn)了20 個(gè)共有峰，分別為峰8、峰11（梔子苷）歸屬于梔子，峰13 歸屬于玄參，峰18（牛蒡苷）歸屬于牛蒡子，峰7、峰12（芒果苷）歸屬于知母，峰17（黃芩苷）、峰19、峰20（漢黃芩苷）、峰21（黃芩素）歸屬于黃芩，峰5、峰10 歸屬于龍膽草，峰2 ～3、峰14 歸屬于連翹，峰4、峰6（綠原酸）、峰9、峰15 歸屬于金銀花，其中峰1 在玄參、大青葉、地黃及地丁中均有出現(xiàn)。

圖2 SQM 共有峰化學(xué)成分指認(rèn)及歸屬HPLC 圖Fig 2 HPLC of common peak chemical composition identification and attribution for SQM

2.5 化學(xué)模式識(shí)別

2.5.1 CA 采用z-score 標(biāo)準(zhǔn)化法將12 批SQM供試品22 個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過(guò)SPSS 20.0 軟件進(jìn)行聚類分析（見(jiàn)圖3）。聚類結(jié)果表明，在歐氏平方距離為10 時(shí)，可將12 批SQM分為兩類，其中S3、S6、S7、S9、S12聚合為一類，其余樣品為一類。說(shuō)明批次間SQM 存在差異，這可能與飲片的產(chǎn)地、廠家、批次等差異有關(guān)，提示應(yīng)保持SQM 飲片來(lái)源的均一性和穩(wěn)定性。

圖3 12 批雙石清熱合劑聚類分析圖Fig 3 Cluster analysis of 12 batches of Shuangshi Qingre mixture

2.5.2 PCA 12 批SQM 共有峰峰面積z-score 標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 20.0 和SIMCA 14.1軟件，進(jìn)行PCA[12]。以特征值＞1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到5 個(gè)主成分，累積方差貢獻(xiàn)率86.7%，能概括色譜圖絕大部分信息。由結(jié)果可知，12 批SQM 分為兩類，S3、S6、S7、S9、S12 聚合為一類，其余樣品為一類，與CA 結(jié)果一致（見(jiàn)圖4）。

圖4 主成分分析得分圖Fig 4 Principal component analysis score chart

2.5.3 OPLS-DA 12 批SQM 的22 個(gè)共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件，以O(shè)PLS-DA 建模分析，得分矩陣圖、載荷散點(diǎn)圖和變量重要投影值圖（見(jiàn)圖5）[13-14]。結(jié)果，在置信區(qū)間（95%）內(nèi)，12 批樣品存在差異，可分為兩類，樣品S3、S6、S7、S9、S12 為一類，其余樣品為一類。OPLS-DA 載荷散點(diǎn)圖，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)共有峰自變量，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，對(duì)樣品的差異性貢獻(xiàn)越大。VIP 圖可篩選出對(duì)樣品差異貢獻(xiàn)較大的成分，以VIP值＞1.0 為參考，共提取出6 個(gè)特征峰，分別為峰17（黃芩苷）、峰11（梔子苷）、峰20（漢黃芩苷）、峰18（牛蒡苷）、峰14、峰6（綠原酸），說(shuō)明這6種成分可能是12 批SQM 分類的差異性標(biāo)志物。

圖5 OPLS-DA 分析結(jié)果圖Fig 5 OPLS-DA analysis

2.6 4 種指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.6.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各化學(xué)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab 2 Regression equation，correlation coefficient and linearity

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、梔子苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷峰面積的RSD均小于1.5%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液（S1）適量，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、梔子苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷峰面積RSD均小于1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（S1）適量，室溫下存放 0、6、12、24、48 h，進(jìn)樣分析，結(jié)果綠原酸、梔子苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷峰面積的RSD均小于1.8%，表明供試品48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的樣品（S11）適量，制備供試品溶液9 份。取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制與樣品含量相同的混合對(duì)照品溶液，精密加入各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50%、100%、150%的混合對(duì)照品溶液，混勻，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果綠原酸、梔子苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷平均回收率在98.90%～101.42%，RSD均小于2.6%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.6.7 樣品含量測(cè)定 取12 批SQM 供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果綠原酸、梔子苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷含量分別為0.075 ～0.096、0.126 ～0.159、0.496 ～0.586、0.075 ～0.093、0.071 ～0.098 mg·g－1（見(jiàn)表3）。由結(jié)果分析可知，12 批SQM 的化學(xué)成分種類和數(shù)目基本一致，但5 種指標(biāo)成分含量存在一定差異，這可能與飲片的來(lái)源、產(chǎn)地及批次間差異有關(guān)。

表3 雙石清熱合劑中5 種成分的含量Tab 3 Content of 5 ingredients in Shuangshi Qingre mixture

3 討論

3.1 色譜方法考察

本研究考察了不同色譜柱（Agilent、YMC、Phenomenex、GL Sciences），不同流動(dòng)相[乙腈-水、乙腈-（0.1%磷酸-水）、乙腈-（0.1%甲酸-水）、乙腈-（0.05%甲酸-水）]，不同流量體積（0.8、1 mL·min－1），不同柱溫（35、40℃）及不同檢測(cè)波長(zhǎng)（230、239、276 nm）對(duì)色譜圖的影響，最終確定為本文色譜條件。

3.2 含量測(cè)定指標(biāo)成分選定

本研究指認(rèn)了20 個(gè)色譜峰的歸屬，確認(rèn)了綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷及黃芩素7 種化學(xué)成分的特征峰；在OPLSDA 試驗(yàn)中，以VIP 值＞1 為特征，篩選出6 個(gè)成分，峰17（黃芩苷）、峰11（梔子苷）、峰20（漢黃芩苷）、峰18（牛蒡苷）、峰14 及峰6（綠原酸）。結(jié)合文獻(xiàn)資料當(dāng)歸中藥理活性成分的綜合研究，發(fā)現(xiàn)綠原酸在抗菌、抗炎等方面有較強(qiáng)藥理活性[15]，梔子苷有抗感染和免疫調(diào)節(jié)作用[16]，黃芩苷及漢黃芩苷具有清熱瀉火、抗炎、抗病毒等藥理活性[17]，牛蒡苷具有抗炎、抗氧化、抗流行性感冒、抗菌等藥理活性作用[18]，均與本方治療肺胃實(shí)熱、口舌生瘡、牙齦腫痛及上呼吸道感染等功效聯(lián)系緊密，故選擇作為差異性標(biāo)志物進(jìn)行含量測(cè)定，以期為SQM 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。