響應(yīng)面法優(yōu)化醋炙延胡索炮制工藝研究

暴慧軍，李沁（.河南省直第三人民醫(yī)院 藥劑科，鄭州 450006；.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，鄭州 450008）

延胡索為罌粟殼植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥塊莖，有活血、行氣、止痛等功效，可用于胸脅、脘腹疼痛，胸痹心痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，產(chǎn)后瘀阻，跌打腫痛等癥[1]。其主要成分為具有鎮(zhèn)痛作用的生物堿類，此外還含有抗菌抗炎作用的揮發(fā)油、多糖類等成分[2-4]。延胡索的不同炮制品均有鎮(zhèn)痛抗炎作用，其中以醋炙為佳，現(xiàn)臨床上多選用醋炙延胡索[5]。在臨床使用過程中，中藥臨床療效的好壞與其炮制工藝是否得當(dāng)密切相關(guān)[6]，隨著中藥飲片使用率的逐年增加，傳統(tǒng)的中藥炮制工藝已無法滿足市場要求[7]，現(xiàn)代化的炒藥設(shè)備大量投入使用，但中藥飲片的相關(guān)炮制標準目前仍無法制定，現(xiàn)多依靠從事炮制工作的工人根據(jù)經(jīng)驗對炮制輔料、溫度、時間、炮制終點等進行判斷，人為的判斷標準個體化差異較大，炮制工藝無法標準化[8-9]。基于此，本研究以總生物堿、延胡索乙素、原阿片堿和揮發(fā)油含量及外觀性狀為指標，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法和綜合評分法考察輔料用量、炒制溫度、炒制時間對延胡索醋炙炮制工藝的影響進行相關(guān)研究，以期為延胡索醋炙炮制工藝的標準化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

CY-25 炒藥機（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）；HZT-B6000 電子天平（華志電子科技有限公司）；BSA224S-CW 電子天平、電子天平CP225D（德國賽多利斯）；Thermo Evolution201 紫外-可見分光光度計（賽默飛世爾科技）；1260Agilent 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；18120 純水裝置（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）；LXJ-ⅡB 飛鴿臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DZF-6126LG 真空干燥箱（上海齊欣實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DHG-9246A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；PHSJ-3F PH 計（上海創(chuàng)益儀器儀表有限公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

延胡索（批號：190214，安徽人民中藥飲片有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部王宏賢副主任中藥師鑒定符合《中國藥典》2020年版一部相關(guān)規(guī)定）；米醋（廣東廚邦食品有限公司）；延胡索乙素（批號：Y21S7Y17091）、原阿片堿（批號：Y12J10L90499）（上海源葉生物科技有限公司，純度≥ 98%）。甲醇、磷酸、三乙胺為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總生物堿含量測定[10]

2.1.1 溶液的制備

① 對照品溶液的制備：取延胡索乙素對照品適量，精密稱定，加入無水乙醇，制成含延胡索乙素86 μg·mL－1的對照品溶液。

② 供試品溶液的制備：取延胡索粉末1 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入60%的乙醇20 mL 加熱回流提取兩次，每次1.5 h，過濾，合并濾液并揮干，滴加稀鹽酸調(diào)pH 值為2，每次加入10 mL 三氯甲烷萃取，萃取兩次，滴加氨水調(diào)pH 值為11，再加入8 mL 超純水洗滌，將下層三氯甲烷溶液放出后，在蒸發(fā)皿中揮干三氯甲烷，加入無水乙醇溶解，定容于50 mL 的量瓶中，即得供試品溶液。

2.1.2 測定波長的確定 取“2.1.1”項下對照品和供試品溶液各1.5 mL，加入無水乙醇定容于10 mL 的量瓶中，以無水乙醇溶液為空白對照，在波長200 ～400 nm 處，進行掃描，對照品和供試品溶液在280 nm 處有最大吸收，因此確定延胡索總生物堿的測定波長為280 nm。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密吸取延胡索乙素對照品溶液0.7、2、3、4、7、9 mL，置于10 mL量瓶中加入無水乙醇定容，于280 nm 處測定吸光度，以對照品溶液的質(zhì)量濃度（μg·mL－1）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程：A＝0.0123C＋0.0773，R2＝0.9998，延胡索乙素在6.02 ～77.4 μg·mL－1內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 方法學(xué)考察 分別對延胡索乙素的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率進行考察，所得的胡索乙素的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性RSD值分別為0.16%、2.9%、2.1%，平均加樣回收率為98.6%，RSD值為2.3%，表明該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率良好。

2.2 延胡索乙素和原阿片堿的含量測定[11-12]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent HC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（55∶45），三乙胺調(diào)pH 至6.0；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長280 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。

2.2.2 溶液的制備[13]

① 對照品溶液的制備：取延胡索乙素和原阿片堿對照品適量，精密稱定，置于25 mL 的量瓶中加入甲醇溶解并定容，制成含延胡索乙素126.0 μg·mL－1、原阿片堿135.2 μg·mL－1的混合對照品溶液。

② 供試品溶液的制備：取延胡索不同炮制品粉末0.5 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加甲醇-濃氨水溶液（20∶1）25 mL，稱定質(zhì)量，將錐形瓶放入冷水中，冷浸1 h，加熱回流1 h，冷卻至室溫，用甲醇-濃氨水溶液補足減少質(zhì)量，振搖、過濾，濾渣用甲醇沖洗并過濾，合并濾液，置于蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣用甲醇溶解置于5 mL 的量瓶中，定容，即得。進樣前用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，進樣，測定，記錄色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）和供試品（B）高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of mixed reference（A）and sample（B）

2.2.3 標準曲線繪制 精密吸取“2.2.2”項下延胡索乙素與原阿片堿混合對照品溶液1、2、3、5、7、10 mL，分別置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，配制成延胡索乙素質(zhì)量濃度為12.6、25.2、37.8、63、88.2、126.0 μg·mL－1，原阿片堿質(zhì)量濃度為13.5、27.0、40.6、67.6、94.6、135.2 μg·mL－1的系列混合對照品溶液，進樣測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程及線性范圍分別為：延胡索乙素Y＝9.679X＋10.15（r＝0.9999），12.6 ～126.0 μg·mL－1；原阿片堿Y＝10.20X＋3.796（r＝0.9999），13.5 ～135.2 μg·mL－1。

2.2.4 方法學(xué)考察 分別對延胡索乙素、原阿片堿的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率進行考察，所得延胡索乙素的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性RSD值分別為0.32%、1.2%、1.4%，平均加樣回收率為96.50%，RSD值為1.0%；原阿片堿的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性RSD值分別為0.79%、1.3%、1.3%，平均加樣回收率為97.75%，RSD值為2.0%。表明該方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率良好。

2.3 延胡索醋炙炮制工藝設(shè)計

2.3.1 試驗設(shè)計 根據(jù)《中國藥典》2020年版四部炮制通則規(guī)定，醋炙法的輔料量為每100 kg 藥材加米醋量為20 kg，文火炒；基于此規(guī)定本試驗將輔料用量控制在10 ～30 kg，文火溫度調(diào)節(jié)為110 ～150℃，炒制時間設(shè)置為5 ～15 min，確定輔料用量、炒制溫度、炒制時間三個因素為自變量，以總生物堿、延胡索乙素、原阿片堿含量和外觀性狀指標為效應(yīng)值。根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計原理[14]和多指標綜合評分法[15]，采用三因素三水平進行分析，試驗設(shè)計因素及水平見表1。

表1 因素與水平Tab 1 Factor and level

2.3.2 綜合評分法優(yōu)化醋延胡索炮制工藝 揮發(fā)油含量測定[1，16]采用《中國藥典》2020年版四部通則揮發(fā)油測定法進行測定，測定結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Tab 2 Design and results of response surface

外觀性狀以片型整齊、悶潤透，飲片顏色均勻，表面黃色或黃褐色，角質(zhì)樣，具蠟樣光澤，略有醋香氣為佳，總分計為10 分。

用多指標試驗的綜合評分公式，對效應(yīng)面試驗結(jié)果進行分析。總生物堿的最高量計為 20 分，延胡索乙素的最高量計為20 分，原阿片堿的最高量計為20 分，揮發(fā)油含量的最高量計為20 分，外觀性狀的最高評分計為 20 分，各樣品分別計算綜合評分值，分析結(jié)果見表2。

綜合評分Y＝（X1/X1max）×20 ＋（X2/X2max）×20 ＋（X3/X3max）×20 ＋（X4/X4max）×20 ＋（X5/X5max）×20，其中X1為總生物堿的量，X2為延胡索乙素的量，X3為原阿片堿的量，X4為揮發(fā)油含量，X5為外觀性狀評分值，響應(yīng)面分析結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

以綜合評分為效應(yīng)值，采用Design Expert 8.0 軟件對試驗結(jié)果進行回歸分析，得到經(jīng)擬合后的回歸模型方程為：Y＝89.81 ＋4.54A＋3.14B－2.24C＋1.85AB－0.54AC－0.17BC－6.60A2－6.67B2－1.90C2。由表3 可知，該模型P＜0.0001，有很好的顯著性，且失擬程度P＝0.0582 ＞0.05，不顯著，表明該模型能夠較好地反映輔料用量（A）、炒制溫度（B）、炒制時間（C）與總生物堿、延胡索乙素、原阿片堿、總揮發(fā)油、外觀性狀含量之間的變化關(guān)系，可用來對該炮制工藝進行分析和預(yù)測；根據(jù)方差分析結(jié)果可知，試驗因素A、B、C、AB、A2、B2、C2項的P值均＜0.05，說明該項對綜合評分均有顯著影響，且單因素對綜合評分的結(jié)果大于交互項。

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 ANOVA results

效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測根據(jù)回歸模型方程，將悶潤時間、炒制溫度和炒制時間對總評分的影響繪制成效應(yīng)面圖2；根據(jù)模型分析結(jié)果及相應(yīng)的效應(yīng)面圖和等高線圖，得到醋炙延胡索炮制的最佳工藝條件為：輔料用量24.13 kg，炮制溫度136.01℃，炮制時間6.67 min。

圖2 各因素交互作用對綜合評分影響的響應(yīng)曲面圖Fig 2 Response surface of interactive effect on the comprehensive score

2.3.3 工藝驗證 根據(jù)試驗結(jié)果再結(jié)合實際操作的可行性，將最佳炮制工藝調(diào)整為：輔料用量24 kg，炒制溫度135℃，炒制時間7 min。取6 份生品延胡索，按照以上工藝炮制成醋延胡索飲片，分別測定每份炮制品中的總生物堿、延胡索乙素、原阿片堿、總揮發(fā)油含量，并對其外觀性狀進行評分，最終所得綜合評分的均值為92.03，RSD值為1.4%，與理論預(yù)測值91.96 相近，表明該炮制工藝合理可行。

2.3.4 炮制工藝參數(shù)與各評價指標相關(guān)性分析通過對醋炙延胡索的炮制工藝優(yōu)化，依照醋炙延胡索炮制工藝參數(shù)以及各評價指標，利用SPSS 22.0 軟件[17]列出相關(guān)系數(shù)矩陣，依據(jù) Pearson 系數(shù)進行相關(guān)性檢驗，具體結(jié)果見表4。

表4 炮制工藝與各評價指標相關(guān)性分析Tab 4 Correlation of process technology and evaluation index

根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果可知，輔料用量與總生物堿含量和外觀性狀成顯著正相關(guān)；炮制溫度與原阿片堿含量成顯著正相關(guān)，與總揮發(fā)油含量成負相關(guān)；總生物堿含量與外觀性狀和綜合評分成顯著正相關(guān)；延胡索乙素含量與原阿片堿和綜合評分成顯著正相關(guān)，與總揮發(fā)油含量成顯著負相關(guān)；原阿片堿與總揮發(fā)油成顯著負相關(guān)；外觀性狀與綜合評分成顯著正相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

本試驗通過多指標綜合評分法及響應(yīng)面法對醋炙延胡索炮制工藝進行優(yōu)化，最終優(yōu)化出的最佳炮制工藝為輔料用量24 kg，炒制溫度135℃，炒制時間7 min。通過對炮制工藝參數(shù)及各評價指標的相關(guān)性進行分析，各炮制工藝參數(shù)并非與所有的評價指標均有顯著相關(guān)性，但綜合評分與總生物堿含量、延胡索乙素及外觀性狀成顯著正相關(guān)，可為后期優(yōu)化評價指標提供參考；另外炮制時間與各評價指標無顯著相關(guān)性，受樣本量小的影響，后期試驗過程中需增加樣本數(shù)量、批次等加以驗證。

在中藥炮制過程中，炮制工藝無統(tǒng)一標準，工藝參數(shù)差異較大，中藥飲片生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定，導(dǎo)致飲片質(zhì)量不可控，這些都會對中藥的臨床療效產(chǎn)生巨大的影響[18-19]。以“整體觀念”為切入點，增加除有效成分、外觀性狀以外的其他評價指標，如飲片本身的物理性質(zhì)pH、膨脹度、黏度、脆碎度等，大分子物質(zhì)淀粉、多糖、纖維含量等，將中藥本身的形、色、氣、味、質(zhì)相融合[13]，作為炮制工藝評價的整體指標，為構(gòu)建更為多元化的炮制中藥飲片相關(guān)質(zhì)量檢驗標準作出新嘗試。