HPLC定性定量分析-模式識別研究沙棘銀花顆粒提取工藝

華若辰，拓文靜，宋自娟，劉建書，盧聞*（.西安交通大學醫學部藥學院，西安 7006；.陜西省功能食品工程技術研究中心，西安 70054）

中藥提取是中成藥及中藥相關產品生產的重要工藝環節，優良的中藥提取工藝可以降低成本，減少對環境的污染，提高提取效率。目前對于中藥提取工藝的研究多采用正交[1-3]或均勻試驗設計[4]，設置料液比、提取時間、提取次數等考察因素和水平，以浸膏得率和指標成分轉移率為指標，評價和篩選提取工藝[5-6]。然而，中藥來源廣泛、組成復雜，容易造成產品執行生產時出現較大偏差，質量波動大，因此，建立較為全面的綜合評價方法非常有必要。沙棘銀花顆粒是由金銀花、沙棘、甘草3種藥食同源藥材組成的中藥組方。本文以提取溶劑種類、用量和提取時間為考察因素，結合HPLC 特征圖譜定性分析、相似度分析、聚類分析及指標成分定量分析，建立一種沙棘銀花顆粒提取工藝及過程研究的綜合評價方法。

1 試藥

維采寧-2（批號：HR1254W1）、異綠原酸B（批號：H1021136198）、芹糖甘草苷（批號：HR12311W2）（寶雞市辰光生物科技有限公司，純度均為98%）；槲皮素（批號：100081-200907，純度：97.5%，中國食品藥品檢定研究院）；甘草、金銀花、沙棘均購自北京同仁堂（西安小寨店，經西安交通大學藥學院牛曉峰教授鑒定為正品）。色譜甲醇（美國TEDIA 試劑公司）；試驗用水為超純蒸餾水（優普超純水機制備）；其他分析純試劑與試藥購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

取維采寧-2、芹糖甘草苷、異綠原酸B 和槲皮素對照品，精密稱定，甲醇溶解并制成維采寧-2、異綠原酸B 和槲皮素質量濃度均為100.0 μg·mL－1、芹糖甘草苷質量濃度為1.00 mg·mL－1的對照品儲備液。精密吸取各對照品儲備液適量置100 mL 量瓶中，甲醇稀釋、定容，制得含維采寧-2 為2.0 μg·mL－1、異綠原酸B為3.0 μg·mL－1、槲皮素為1.0 μg·mL－1、芹糖甘草苷為40.0 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

金銀花、甘草、沙棘經粉碎后，稱定金銀花粗粉7.0 g、沙棘粗粉6.0 g、甘草粗粉3.0 g，置圓底燒瓶中，加入提取溶劑，稱定質量，回流提取（提取溶劑種類、用量及提取時間見表1）。回流結束放至室溫，稱定質量，新鮮提取溶劑補足減失的質量，濾過，減壓回收溶劑。濃縮至干，稱定所得干膏質量。按如下公式計算浸膏得率：

表1 提取工藝參數Tab 1 Extraction process parameters

浸膏得率（%）＝浸膏量/生藥投入量×100%

粉碎所得干膏，取適量，精密稱定，置量瓶中，甲醇超聲溶解，室溫定容，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

應用LC-2030C 3D 高效液相色譜儀（SHIMADZU，Japan）和LC Solution 色譜工作站進行HPLC分析。色譜柱：Diamonsil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）（美國Welch 公司）；流動相：0.02%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（見表2）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：維采寧-2 為339 nm，芹糖甘草苷為276 nm，異綠原酸B 為327 nm，槲皮素為304 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution program

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一批（S2）供試品溶液，連續進樣6 次，結果各共有峰相對保留時間RSD均小于1.5%，相對峰面積RSD均小于2.4%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取同一批（S2）供試品粉末6份，精密稱定，甲醇溶解定容，進樣測定，結果各共有峰相對保留時間RSD均小于2.1%，相對峰面積RSD均小于2.7%，表明方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一批（S2）供試品溶液，分別于0、4、8、12 和24 h 進樣測定，結果各共有峰相對保留時間RSD均小于2.2%，相對峰面積RSD均小于2.9%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.5 HPLC 特征圖譜建立

取各工藝所得樣品（S1 ～S7），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣分析，記錄色譜圖。將所得色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012A，以S1 為參照圖譜，中位數法生成7 組樣品的對照特征圖譜，通過多點校正和色譜峰匹配，確定20 個共有峰，HPLC 特征圖譜疊加圖見圖1。以共有峰2 為參照峰，計算20 個共有峰的相對保留值，相對保留時間RSD均小于0.7%，而共有峰的相對峰面積RSD值波動較大，除參照峰2 外，跨度在11.5%～214.5%，可見峰面積受提取工藝影響較大。

圖1 7 種工藝提取物HPLC 特征圖譜疊加圖（248 nm）Fig 1 HPLC characteristic chromatogram of extraction products from 7 extraction processes（248 nm）

2.6 相似度評價

利用指紋圖譜相似度評價軟件[7]進行相似度分析，結果表明，7 種工藝整體相似度高于0.80，其中醇提工藝S1 與S2 相似度大于0.99，水提工藝S3 ～S7 相似度均大于0.98，見表3。

表3 7 種工藝提取物相似度Tab 3 Similarity of 7 extraction processes

2.7 聚類分析

采用系統聚類分析法[8]對7 種工藝的色譜數據進一步分析，以保留時間為7.84 min 的2 號峰為參照峰，計算20 組共有峰的相對峰面積（見表4）。將20 組相對峰面積導入SPSS 23 軟件，采用組間連接法，以歐式距離作為測度，得到水平方向上的聚類分析譜系圖（見圖2），觀察7 種工藝之間的差異。聚類分析結果表明，當分類距離為25 時，醇提工藝（S1、S2）和水提工藝（S3、S4、S5、S6、S7）分別聚為一類；當分類距離小于20 時，水提工藝中的S7 單獨為一小類，S3、S4、S5、S6 為另一小類。

表4 7 種工藝提取物HPLC 特征圖譜共有峰的相對峰面積Tab 4 Relative area of HPLC characteristic chromatogram common peaks of 7 extraction processes

圖2 7 種工藝聚類分析譜系圖Fig 2 Cluster analysis diagram of fingerprint for 7 extraction processes

2.8 指標成分含量測定

定量分析了7 種工藝提取的浸膏得率和3 味藥材中指標成分（維采寧-2、芹糖甘草苷、異綠原酸B 和槲皮素）含量（見圖3），根據浸膏中指標成分含量計算生藥中的指標成分含量，見表5。S4 ～S6 浸膏得率相近且較高；S1、S3 和S7 的浸膏得率相近且次之于S4 ～S6；S2 浸膏得率最低。以生藥量為基準的指標成分含量比較，維采寧-2 以工藝S4 得率最高，S2 最低；芹糖甘草苷以工藝S1 得率最高，S7 最低；異綠原酸B 以工藝S4 得率最高，S1 最低；槲皮素含量以工藝S2 最高，S6 最低。綜上分析可知，工藝S4 所得提取浸膏中維采寧-2 和異綠原酸B 成分含量為7 種工藝中最高；所得芹糖甘草苷和槲皮素含量僅次于工藝S1 和S2，但均高于工藝S3 以及S5 ～S7。

表5 浸膏得率及指標成分含量Tab 5 Extraction yield and principal component content

圖3 指標成分HPLC 圖Fig 3 HPLC fingerprint of principal components

3 討論

中藥指紋圖譜是一種國內外廣泛接受的中藥質量評價模式，可以作為現代中藥質量標準體系的核心技術和基石[9-10]。隨著《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》的推行實施，以及分析儀器和技術的不斷更新，中藥指紋圖譜技術已應用到中藥材及中藥產品的生產、加工、貯存和流通各環節的質量監控[11-12]。然而，單一的指紋圖譜分析在中藥質量監控上顯得不足，應用指紋圖譜技術結合指標成分定量的評價方法逐漸成為主流[13-14]。近年來，指紋圖譜結合化學模式識別的分析方法作為新的評價方法已應用到中藥質量監控[15-16]。基于此，本文采用HPLC 特征圖譜定性分析和指標成分定量分析，結合模式識別，對沙棘銀花顆粒提取工藝進行了評價。

本文采用梯度洗脫程序和二極管陣列檢測進行HPLC 圖譜的共有峰識別和指標成分定量分析，運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統分析7 種工藝所得沙棘銀花浸膏的特征圖譜，并確定了20個共有峰。在此基礎上，進行相似度及聚類分析，結果水提、醇提工藝分別聚為一類，可知提取溶劑是工藝差異的主要影響因素；而在水提工藝中，S3、S4、S5 和S6 的共有峰相對峰面積較為接近。綜合浸膏得率和指標成分定量分析可知，工藝S4在7 種工藝中有相對高的成分轉移率，即12 倍量水為提取溶劑，提取時間為2 h。

進一步分析考察因素的影響，不同提取溶劑工藝S1、S2 和S3（75%乙醇、95%乙醇和水），S1和S2 有較高相似度，而指標成分維采寧-2 和芹糖甘草苷以S1 轉移率為高，指標成分異綠原酸B 以S3 轉移率為高，槲皮素以S2 轉移率為高；不同提取溶劑用量工藝S3、S7 和S5（8、12 和15 倍量），三者的相似度較高，指標成分維采寧-2、芹糖甘草苷和異綠原酸B 轉移率以S5 為高；不同提取時間工藝S7、S4 和S6（1 h、2 h 和3 h），三者同樣有較高的相似度，4 種指標成分以S4 轉移率為高。

綜上，本文以基本的提取工藝參數為考察，應用HPLC 特征圖譜定性分析結合相似度、聚類分析和指標成分定量分析，對沙棘銀花顆粒提取工藝進行了多指標的綜合評價，可為指紋圖譜技術在中藥產品各環節的拓展應用提供參考。