液相色譜串聯質譜法測定人血漿中硫酸黏菌素的濃度

馬穎超，董維沖，吳瑕，楊秀嶺（河北醫科大學第二醫院藥學部，石家莊 050000）

黏菌素（又稱多黏菌素E）是一種含多種組分的陽離子多肽類抗菌藥物，于1950年從大腸埃希菌中分離得到，其結構是脂肪酸鏈通過酰胺鍵與陽離子十肽環連接。黏菌素主要成分為多黏菌素E1（C53H100N16O13）和多黏菌素E2（C52H98N16O13），兩者區別僅是脂肪酸側鏈相差一個甲基，多黏菌素E1為6-甲基辛酸，多黏菌素E2為6-甲基庚酸[1]，這兩種成分占黏菌素總含量的85%以上[2]，決定其主要血藥濃度和臨床抗菌活性[3]。硫酸黏菌素，原名硫酸抗敵素，又稱硫酸多黏菌素E，是1966年我國自主研發的抗菌藥物。硫酸黏菌素與多黏菌素E 甲磺酸鹽不同，無需轉化，直接殺菌。因市場用量少，曾經停產。近年來，由于臨床耐藥菌的廣泛出現，硫酸黏菌素對多重耐藥及泛耐藥革蘭氏陰性桿菌特別是銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌有強大的抗菌活性，被作為治療這些多重耐藥菌感染的最后一道防線，于2018年重新上市，用于危重患者嚴重感染的治療[4]。但由于其上市較早，未經歷過現代藥物開發程序，早期的藥動學、藥效學、毒理學等資料非常有限，缺少指導臨床使用的相關信息。其治療窗窄，不良反應發生率高[5-6]，尤其在重癥感染患者中，臨床個體差異大，需要進行血藥濃度監測[7]，以便實現個體化給藥。本文建立一種液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）法測定人血漿中硫酸黏菌素主要成分多黏菌素E1和多黏菌素E2的濃度，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器

LC-20C 高效液相色譜儀（日本島津），API4000＋三重四級桿質譜儀（Applied Biosystem，美國），離心機（德國ABBOTT），渦旋混合器（XW-80A，上海醫科大學儀器廠），低溫冰箱（MDF-U2086S，日本三洋），冷藏柜（YC-180，澳柯瑪），電子分析天平（CPA225D，德國Sartorius）。

1.2 試藥

硫酸黏菌素對照品（含量：95.1%，批號：833621）、內標硫酸多黏菌素B（含量：88.1%，批號：174224）（德國Dr Ehrenstorfer 公司）；人血漿（河北省血液中心）；甲酸（色譜純，上海Aladdin）；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。流動相A：水（含0.1%甲酸），流動相B：乙腈（含0.1%甲酸），梯度洗脫（0 ～1 min，95%A；1～5 min，25%A；5～7 min，5%A；7 ～9 min，95%A）；流速：0.8 mL·min－1；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），多重反應離子監測（MRM）正離子模式，噴霧電壓（IS）：5500 V，離子源溫度（TEM）：550℃，氣簾氣壓力（CUR）：10 psi，霧化器壓力（GAS1）：55 psi，輔助氣壓力（GAS2）：55 psi，碰撞氣壓力（CAD）：4 psi。多黏菌素E1、多黏菌素E2和內標多黏菌素B 的定量離子對分別為m/z585.7 →101.2、m/z578.8 → 101.2 和m/z602.7 → 241.4，去簇電壓（DP）分別為61 V、59 V 和68 V，碰撞電壓（CE）分別為47 V、49 V 和33 V。

2.3 對照品溶液和內標溶液的配制

精密稱取硫酸黏菌素、硫酸多黏菌素B 對照品各20 mg，分別置于10 mL 量瓶中，用20%甲醇溶解并稀釋成質量濃度為2 mg·mL－1的硫酸黏菌素儲備液和內標儲備液。精密量取硫酸黏菌素儲備液適量，以20%甲醇逐級稀釋成質量濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg·mL－1的系列標準工作液和質量濃度為1、10、80 μg·mL－1的質控工作液，用20%甲醇稀釋內標儲備液為40 μg·mL－1作為內標工作液，4℃冰箱儲存備用。

2.4 血漿樣品處理

取血漿200 μL，加入20 μL 內標工作液（40 μg·mL－1），渦旋混勻后加入400 μL 甲醇-5%三氯乙酸（50∶50，V/V），渦旋2 min，10 900 r·min－1離心5 min，取上清液200 μL 進樣。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性 取人空白血漿、人空白血漿＋硫酸黏菌素對照品儲備液（5 μg·mL－1）＋內標工作液（40 μg·mL－1）、臨床患者用藥后血漿樣品，按“2.4”項下方法處理分析。結果多黏菌素E1、多黏菌素E2和內標的保留時間分別為5.64、5.54和5.68 min。峰形良好，血漿中內源性物質在待測物保留時間處無干擾，結果見圖1。

圖1 硫酸黏菌素的HPLC-MS/MS 色譜圖Fig 1 HPLC-MS/MS chromatogram of colistin sulfate

2.5.2 標準曲線與定量限 將“2.3”項下配制好的硫酸黏菌素系列標準工作液分別加入到空白血漿中制備成質量濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg·mL－1的標準曲線溶液。按“2.4”項下方法處理后進樣，以多黏菌素E1和多黏菌素E2總濃度為橫坐標，多黏菌素E1和多黏菌素E2總峰面積與內標物的峰面積比值為縱坐標，以加權最小二乘法進行線性回歸運算，得硫酸黏菌素標準曲線方程為y＝1.851x－0.059（r＝0.9982），在0.1 ～10 μg·mL－1與峰面積線性關系良好。定量限（LOQ）為0.1 μg·mL－1。

2.5.3 精密度與準確度 取“2.3”項下硫酸黏菌素系列質控工作液，分別加入到空白血漿中制得低（0.1 μg·mL－1）、中（1 μg·mL－1）、高（8 μg·mL－1）質控工作液，按“2.4” 項下方法處理，每個濃度平行做5 份，連續測定3 d，根據當日標準曲線計算日內和日間精密度、準確度，結果見表1。

表1 精密度和準確度試驗結果(n ＝5)Tab 1 Precision and accuracy tests (n ＝5)

2.5.4 提取回收率和基質效應 取“2.5.3”項下3個濃度的質控工作液，按“2.4” 項下方法處理，作為樣品A；取空白血漿進行預處理后的上清液，加入系列質控工作液，制得低、中、高質控工作液，作為樣品B；另配制同濃度標準溶液，作為樣品C，每個質控濃度各5 份。將3 組樣品同法進行HPLCMS/MS 分析，用樣品A 的峰面積與樣品C 的峰面積比計算提取回收率，樣品B 的峰面積與樣品C的峰面積比計算基質效應，結果見表2。

表2 提取回收率和基質效應試驗結果(n ＝5)Tab 2 Extraction recovery and matrix effect (n ＝5)

2.5.5 穩定性試驗 制備低、中、高3 種質量濃度硫酸黏菌素質控血漿樣品，考察分別經過室溫放置6 h 和24 h，自動進樣器15℃放置24 h，－20℃凍融循環3 次，－70℃冰箱放置30 d，按“2.4” 項下方法處理后測定血漿樣品的穩定性，得到硫酸黏菌素濃度的RSD均在±15%，穩定性符合相關要求，結果見表3。

表3 穩定性試驗結果(n ＝5)Tab 3 Stability test (n ＝5)

2.6 方法學驗證

用本研究所建方法檢測10 例患者硫酸黏菌素血藥谷濃度，平均年齡為（53.20±24.36）歲，給藥劑量按照說明書規定靜脈滴注每次50 萬IU，每12 h 給藥一次，其中3 例患者給予首劑加倍。硫酸黏菌素谷濃度應在穩態下進行測定，其半衰期在腎功能正常的患者中為6 h，根據藥代動力學理論，需經過4 ～5 個半衰期達到穩態濃度，故可在用藥2 ～3 d 達穩態后取血測定，最終選定第7 劑給藥前30 min 采集血樣，測定硫酸黏菌素穩態谷濃度，結果中最大濃度為1.44 μg·mL－1，最小濃度為0.25 μg·mL－1。同時抽取了其中兩例患者第7 劑給藥后15 ～30 min 血樣，測定硫酸黏菌素峰濃度，分別為1.96 μg·mL－1和1.79 μg·mL－1，結果見表4。

表4 10 例患者硫酸黏菌素峰谷濃度測定結果Tab 4 Cmax and Cmin of colistin sulfate in 10 patients

3 討論

3.1 硫酸黏菌素臨床應用困惑

硫酸黏菌素曾因其腎毒性和神經毒性遭到臨床棄用，僅應用于獸藥中。但隨著多重耐藥菌感染在臨床逐漸增多，在新藥開發有限的前提下，硫酸黏菌素又被重新應用于臨床[8]。但由于硫酸黏菌素未經歷過現代藥物開發程序，缺乏合理應用所需要的藥理學信息，目前對各類患者特別是重癥患者，其給藥方案并沒有得到循證醫學的證實[9]；并且目前應用較少，經驗不足，臨床醫師對硫酸黏菌素的使用存在很大困惑。一方面很多臨床醫師不完全清楚硫酸黏菌素的給藥劑量，原因是各藥企所生產的多黏菌素E 有著不同的標簽和不同的給藥方案，有些為國際單位，有些標有“多黏菌素E 基礎活性”的標簽。這種在標簽以及每日推薦劑量上的不一致，造成臨床醫師對多黏菌素E 的兩種常用劑型黏菌素甲磺酸鹽和硫酸黏菌素的使用劑量產生混亂，對硫酸黏菌素的臨床使用有著非常大的影響。另一方面，近年來很多研究指出硫酸黏菌素的腎毒性發生率和嚴重程度遠低于早期臨床觀察結果，僅在聯用其他腎毒性藥物或劑量過高時可增加腎功能損害發生的可能性[10-12]。文獻報道，硫酸黏菌素導致的腎功能損害是可逆的，停藥后數周至數月內可恢復[13]。盡管如此，在使用硫酸黏菌素時仍需密切監測腎功能且避免聯用有腎毒性的藥物。藥動學和藥效學分析可明晰藥物在體內的吸收、分布、代謝和排泄，從而指導臨床用藥劑量和給藥方式，降低不良反應發生率，因此，當硫酸黏菌素被重新應用于臨床后，對其進行藥動學和藥效學研究顯得越發重要。

3.2 硫酸黏菌素血藥濃度分析方法選擇

現有的多黏菌素E 血藥濃度分析方法有微生物法、免疫法、薄層色譜法、毛細管電泳法[14]和高效液相色譜法（HPLC）[15]。微生物法樣本耗時多且缺乏特異性，免疫法免疫原制備復雜，分析成本高，薄層色譜法和毛細管電泳法重復性差，不具有普遍性[1]。由于多黏菌素E 最大吸收波長為210 nm，有末端吸收，此波長處流動相中的有機相會有一定吸收，因此對檢測器靈敏度和流動相要求苛刻。紫外檢測器會造成基線漂移，數據不可信。熒光檢測器雖然專屬性和靈敏度高，但由于多黏菌素E 沒有原生熒光，需要進行提取和衍生化，操作繁瑣[16]。本文采用LC-MS/MS 法測定人血漿中硫酸黏菌素的濃度，靈敏度高，準確度好，符合《中國藥典》生物樣本檢測方法的要求。

文獻[14-16]中對多黏菌素E 樣品前處理大多采用固相萃取法，但該技術操作繁瑣，不利于大量生物樣品的檢測，且固相萃取板價格昂貴。本研究采用蛋白沉淀樣品的前處理方式，簡化了血漿預處理過程，節約了成本，適用于臨床大量樣本分析。在方法學優化過程中考察了多種流動相，包括水-甲醇、水-乙腈、水（含0.01%甲酸）-乙腈（含0.01%甲酸）、水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）、水（含0.5%甲酸）-乙腈（含0.5%甲酸）、水（含1%乙酸）-乙腈（含1%乙酸），最終選擇本文流動相。通過加入0.1%甲酸使得多黏菌素E1和多黏菌素E2色譜峰峰形良好，響應值得到改善。在洗脫方法研究中，選擇梯度洗脫，首先采用較低比例的有機相沖洗，讓極性物質先流出色譜柱，保證了極性物質和藥物先后流出，避免了基質效應的干擾，并通過調整初始有機相比例得到了較為合適的保留時間和峰形，提高了檢測靈敏度。在內標選擇中，選擇與黏菌素結構和化學性質相似的多黏菌素B，保證完全分離的同時，又可以獲得相似的回收率、離子化效率和色譜保留行為，并且無內源性物質干擾和基質效應干擾。

3.3 硫酸黏菌素血藥濃度檢測結果分析

多黏菌素E 血藥濃度的高低與抗菌效果、腎毒性緊密相關，重癥患者體內多黏菌素E 藥動學變化大，血藥濃度監測不僅能保證治療效果，也能降低腎臟損害的風險。2019年多黏菌素國際共識中建議[17]，多黏菌素E 的推薦靶值為穩態時24 h 血漿藥時曲線下面積（AUCss，24h）達到50 mg·h·L－1，即穩態平均血藥濃度（Css，avg）維持在2 μg·mL－1。該濃度被認為是能耐受的最高暴露量，高于此濃度將增加急性腎損傷的發生率和嚴重性。通過本研究方法檢測10 例患者硫酸黏菌素血藥谷濃度在0.25 ～1.44 μg·mL－1，谷濃度差異較大。其中5 號和8 號患者平均穩態血藥濃度低于指南要求，患者硫酸黏菌素給藥劑量為50 萬IU q12h，符合說明書規定，且患者腎功能正常，但平均穩態血藥濃度不能達標，推測給藥劑量可能偏低，但由于本研究峰濃度樣本量較少，該結論尚需更多峰谷濃度測定來證實。另外，1 號和2 號患者采用首劑加倍給藥方案，其谷濃度分別為1.44 μg·mL－1和1.25 μg·mL－1，明顯高于未采用首劑加倍的患者。計算患者肌酐清除率，1、2 號患者均存在腎功能不全，硫酸黏菌素主要經腎排泄，用藥后8 h 內尿中排出用藥量的40%，腎功能不全者，藥物易在體內蓄積，故血藥谷濃度升高是首劑加倍和腎功能不全兩者同時導致的。但與同樣腎功能不全、未采用首劑加倍的3、4、5 號患者相比，谷濃度也明顯升高，說明首劑加倍可提高硫酸黏菌素的血藥濃度。

綜上，硫酸黏菌素體內個體差異較大，患者腎功能情況可影響藥物排泄，說明書規定50 萬IU q12h 的給藥方案可能存在劑量不足，需采用首劑加倍的給藥方案來增加血藥濃度，提高臨床療效。但由于本研究納入病例數和取血點有限，其他影響硫酸黏菌素體內藥動學的因素尚需更大樣本量、更全面的臨床研究證實，本研究所建方法為進一步研究硫酸黏菌素藥動學-藥效學性質提供了參考。