北柴胡水提液中13種化學成分分析及其肝損傷保護作用研究

楊奇濤，汪玉馨，吳殷囡，劉洋，孟長虹，譚力，陸益紅，史清水（1.中國藥科大學新藥安全評價研究中心，南京 11198；.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，南京 10019；3.徐州醫科大學藥物分析教研室，江蘇 徐州 1004）

北柴胡作為常用的大宗藥材，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣之功效，其藥效成分以柴胡皂苷為主，還有少量其他成分，而在較多的柴胡皂苷同分異構體中，柴胡皂苷A、D 的含量相對較高[1]。目前《中國藥典》一部中普遍用單一或幾個化學成分來對藥材、飲片及其制劑進行定性和定量，這種方法忽略了中藥多組分、多靶點、多途徑協同作用的特點，利用單一或幾個成分進行評價和控制，不能正確衡量中藥的質量與藥效，只有充分利用現代色譜、光譜、質譜手段，特別是液相色譜/質譜聯用技術，才能實現在單次分析中對多個微量及痕量成分，包括同分異構體的定性和定量分析[2-5]。

因此本研究利用HPLC-Q-TOF-MS/MS 技術對北柴胡水提液的有效成分群進行表征，首先通過對各化合物進行鑒定并獲得精確分子量以及充分的碰撞解離碎片信息，并對其二級裂解規律進行了分析，從而鑒定出北柴胡水提液中的主要化學成分，為柴胡以及其相關制劑標準的制訂和體內物質基礎研究提供參考。前期課題組曾對柴胡及其制劑正柴胡顆粒對對乙酰氨基酚（APAP）所致急性肝損傷的作用進行研究，發現柴胡預給藥具有減毒作用[6-8]，故利用APAP 誘導的LO2 肝細胞損傷模型對北柴胡水提液中主要活性成分進行篩選與比較，以期能夠較為全面地評價北柴胡各單體成分的藥效及毒性。

1 材料與儀器

1.1 材料

北柴胡生藥飲片（由南通精華藥業有限公司提供并鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurum chinensisDC.的干燥根）；柴胡皂苷A（純度≥98%，批號：MUST-17120313）、柴胡皂苷B1（純度≥99%，批號：MUST-18010302）、柴胡皂苷B2（純度≥99%，批號：MUST-18032104）、柴胡皂苷B3（純度≥98%，批號：MUST-18060116）、柴胡皂苷B4（純度≥97%，批號：MUST-17110117）、柴胡皂苷C（純度≥98%，批號：MUST-18031402）、柴胡皂苷D（純度≥99%，批號：MUST-17111510）、柴胡皂苷F（純度≥98%，批號：MUST-18031806）、柴胡皂苷G（純度≥98%，批號：MUST-18072216）、柴胡皂苷H（純度≥98%，批號：MUST-18040205）、柴胡皂苷I（純度≥97%，批號：MUST-18072205）、山柰苷（純度≥99%，批號：MUST-18042701）、黃芩苷（純度≥98%，批號：MUST-18010408）（對照品，成都曼斯特生物科技有限公司）；對乙酰氨基酚[純度≥99%，批號：G1816129，阿拉丁試劑（上海）有限公司]。

人源化非腫瘤肝細胞LO2（中國科學上海院細胞研究所）；DMEM 培養基（批號：8119007）、胎牛血清（批號：1828728）、青霉素-鏈霉素溶液（含10 000 單位·mL－1青霉素和10 000 μg·mL－1鏈霉素，批號：1970741）（美國GIBCO 公司）；0.25%胰酶消化液（美國HyClone 公司，批號：J180013）；二甲基亞砜（DMSO，美國Solarbio 生化試劑公司，批號：MKBP4399V）；MTT 試劑（美國Sigma 公司，批號：1213C0338）；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純，德國默克公司）；其他試劑為分析純；實驗用水均由Millipore 超純水儀制備。

1.2 儀器

AB SCIEX Triple TOF 5600 組合式高分辨質譜儀，包括四元泵溶劑系統、在線脫氣機和自動進樣器（上海愛博才思分析儀器貿易有限公司）；MassLynxTM 質譜工作站（Waters 公司）；真空離心濃縮揮干儀（美國Thermo 公司）；L-550 臺式低速離心機（湖南湘潭離心機有限公司）；Beckman Coulter Allegra 64R 臺式高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；生物安全柜（Thermo 1300series A2，美國賽默飛世爾科技公司）；5%CO2箱培養箱（德國Memmert 公司）；倒置顯微鏡（OLYMPUS IX53）、光學顯微鏡（OLYMPUS BX41）（日本奧林巴斯株式會社）；高壓蒸汽滅菌器（Panasonic MLS-3781L，日本松下電器株式會社）；細胞計數儀（Countstar BioMed，上海睿鈺生物科技有限公司）；全自動酶標儀（Molecular Devices）；超純水機（美國Millipore 公司）。

2 方法

2.1 HPLC-Q-TOF-MS/MS 法分析北柴胡水提液有效成分

2.1.1 北柴胡水提液制備 稱取適量北柴胡生藥飲片，浸泡30 min，首次加10 倍水煎煮90 min，第二次加8.5 倍水煎煮90 min，將所得藥汁水提醇沉24 h 后過濾，合并濾液，并濃縮至1000 mL，每1 mL 北柴胡水提液中含生藥3.8 g，本提取液由南通精華藥業公司協助制備。

2.1.2 樣品前處理 精取北柴胡水提液1 mL，加甲醇9 mL，混勻，4000 r·min－1離心10 min。取上清液，揮干后加50%甲醇1 mL 復溶，13 000 r·min－1離心10 min，取上清液進行HPLC-QTOF-MS/MS 分析。

2.1.3 色譜條件 色譜柱Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）； 柱溫35 ℃；流速0.2 mL·min－1；流動相由水（含0.05%甲酸，A）和乙腈（B）組成，梯度洗脫條件見表1；進樣量2 μL。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution

2.1.4 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），負離子模式；噴霧電壓：－4500 V，離子源溫度：550℃，碰撞能量（CE）：－30℃；霧化氣（GS1）：45 psi，輔助氣（GS2）：55 psi，氣簾氣（CUR）：40 psi；為獲得更多定性信息，采用全掃描模式，掃描范圍為MS1：m/z150 ～1350，MS2：m/z100 ～1300。

2.1.5 數據分析 將HPLC-Q-TOF-MS/MS 所得結果用PeakView 2.1 軟件處理并分析。

2.2 細胞實驗

2.2.1 細胞培養 LO2 細胞培養于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 完全培養基中，在37℃、5%CO2培養箱培養。

2.2.2 APAP 損傷模型構建 將對數期生長的LO2 細胞用0.25%胰酶消化液、離心后重懸。根據實測細胞濃度，用細胞培養液稀釋成1×105個·mL－1的細胞懸浮液備用。

取96 孔細胞培養板，每孔加1×105個·mL－1的細胞懸浮液100 μL，置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h 后，棄去細胞培養液上清液，每孔加100 μL 無血清培養基，培養1 h 后，更換為含APAP 0、0.5、1、2、2.5 mg·mL－1的無血清培養基，處理24 h，光學倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。每孔加MTT（5 mg·mL－1）10 μL，培養4 h 后棄上清液，加入100 μL DMSO 作用5 min 后，震蕩10 min，待紫色結晶完全溶解后以空白孔調零，在自動酶標儀490 nm 波長處讀取各孔吸光度值（OD值），計算APAP 的IC50值。

2.2.3 北柴胡水提液13 種主要成分的預保護作用篩選 實驗分為空白對照組、模型組（APAP，1.2 mg·L－1）、預給藥組（柴胡各主要成分對照品，給藥濃度為0.4 mg·L－1與2.0 mg·L－1，該濃度由前期預實驗結果所得）。取96 孔細胞培養板，每孔加1×105個·mL－1的細胞懸浮液100 μL，置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，棄去細胞培養液，空白對照組與模型組更換為無血清培養基，實驗組更換為含藥無血清培養基，培養1 h 后，除空白對照組外，其余各組均加入APAP 造模處理24 h，光學倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。每孔加MTT（5 mg·mL－1）10μL，培養4 h 后棄上清液，加入100 μL DMSO 作用5 min 后，震蕩10 min，待紫色結晶完全溶解后以空白孔調零，在自動酶標儀490 nm 波長處讀取各孔吸光度值，計算LO2 細胞存活率。

3 結果

3.1 北柴胡水提液化學成分鑒定

在負離子模式下，北柴胡化學成分的特征離子主要為[M-H]－、[M+HCOO]－，通過一級質譜采集，得到了各化合物的母離子精確分子量信息，并根據該信息及軟件預測功能，推測出可能的化學元素組成。通過查閱文獻并結合二級碎片信息，對主要化學成分進行推測，通過對照品的保留時間及質譜參數，對北柴胡水提液中相應豐度較高的化合物進行確證。北柴胡水提液總離子流圖譜見圖1，鑒定出的北柴胡水提液中13 種化學成分結構式見圖2，13 種化學成分提取離子流圖譜見圖3，表2中列出了北柴胡水提液中13 種化學成分的保留時間、化學式等信息。

圖3 北柴胡水提物中13 種化合物在負離子模式下的EIC 色譜圖Fig 3 EIC chromatogram of the 13 chemical constituents in the aqueous extract of Bupleurum chinensis DC.in negative ion mode（ESI－）

表2 HPLC-Q-TOF-MS/MS 分析的北柴胡水提物中13 種化學成分鑒定的質譜數據Tab 2 Mass spectral data of compounds in the aqueous extract of Bupleurum chinensis DC.by HPLC-Q-TOF-MS/MS

圖1 負離子模式下北柴胡水提物的TIC 色譜圖（ESI－）Fig 1 TIC chromatogram of the aqueous extract of Bupleurum chinensis DC.in negative ion mode（ESI－）

圖2 北柴胡水提物中13 種化學成分的準確鑒定結構Fig 2 Accurate identification of structures of the 13 chemical constituents in the aqueous extract of Bupleurum chinensis DC.

3.2 LO2 肝細胞急性損傷模型IC50 值測定

APAP 誘導LO2 細胞建立的損傷模型因穩定性好、造模時間短在急性肝損傷相關研究中得到越來越多的應用，而對于保肝護肝作用的研究來說造模劑量至關重要，因此通過MTT 法測定不同濃度APAP 對LO2 細胞的效應值（見圖4），將各濃度響應值轉換成細胞生長抑制率，用GraphPad Prism 5 軟件計算出細胞生長抑制達到50%（IC50）時APAP 的質量濃度為1.2 mg·mL－1。

圖4 APAP 誘導的LO2 細胞中IC50 的測定Fig 4 IC50 in LO2 cells induced by APAP

3.3 北柴胡水提液中肝損傷保護作用篩選

通過北柴胡水提液中13種化學成分預給藥后，以1.5 mg·mL－1濃度（略大于50%抑制率時的劑量）的APAP 進行LO2 細胞急性肝損傷誘導，前期預實驗結果發現13 種化學成分的預保護作用差異較大，選取其中保護作用較大的8 種化學成分分為高、低劑量組預給藥，進一步考察其對APAP所致肝損傷的保護作用，結果見表3。由表3 可知高低劑量組結果差異不大，柴胡皂苷F 與黃芩苷與給藥后細胞存活率與模型組相比提高約1.5 倍，可能存在潛在的肝損傷預保護作用。剩余5 種化學成分低劑量給藥對APAP 所致肝損傷的保護作用結果發現，在該劑量下預給藥后與模型組的細胞存活率比值小余1 或約為1（見表3）。

表3 北柴胡水提物中13 種化學成分對肝損傷的預保護作用Tab 3 Pre-protective effect of 13 chemical constituents in the aqueous extract of Bupleurum chinensis DC

4 討論

中藥的物質基礎并不是單一的化合物，而是指其中發揮作用的化學成分（群）[9]。由于中藥化學成分復雜多變，同一藥材因其基原、部位、炮制、提取方式的差異，化學成分種類及其含量均有可能千差萬別，因此中藥藥效物質基礎研究也就成為了中藥現代化的重點和難點[10]。由于中藥基質復雜，許多成分濃度較低、對照品缺乏、結構不穩定，因此中藥化學成分的鑒定是一個繁瑣而又耗時的工作。目前在復雜基質及未知化合物結構鑒定方面應用較多的是液質聯用（LC-MS）及核磁共振技術（NMR），但由于NMR 對化合物結構、濃度均要求較高[11]，無法滿足復雜基質中多組分特別是微量、痕量化合物的鑒定，因此在中藥復方、單體化學成分及體內代謝物鑒定和分析中，質譜技術尤其是高分辨質譜（Q-TOF、ITTOF）應用更為廣泛。Q-TOF 及IT-TOF 掃描速度快、質量范圍寬、全掃描模式下靈敏度高，并可提供大量母離子及子離子精確分子量信息，從而實現復雜基質中化合物的定性、定量[12-14]。

本文利用高分辨飛行時間串聯質譜（Q-TOFMS/MS），對北柴胡水提液中的化學成分進行分析鑒定，根據收集到的母離子的精確分子量信息，利用PeakView 2.1 對化學式進行預測，并根據特征碎片離子信息、查閱文獻以及PubMed 數據庫檢索結果，對化合物結構進行推測。但由于北柴胡水提液中以柴胡皂苷為主，且其多為同分異構體，特征碎片離子相似，故通過借助對照品溶液，根據化合物色譜保留時間對多個成分一一確證，最終確證了13 個化合物。

中藥藥效物質基礎研究也是中藥安全性和有效性的關鍵，如何對原方中的有效成分進行準確識別和科學評價至關重要，通過識別、篩選、驗證環節，將體內外成分與藥理效應相結合，才能更好地找到體內活性成分[15]。目前對于柴胡各成分究竟是保肝還是傷肝這一問題，結論還比較模糊。有研究認為柴胡皂苷D 可通過抑制肝細胞中的PDGF-βR/p38MAPK 信號通路，使LO2 細胞線粒體受損從而激活下游凋亡通路，同時激活細胞膜上的fas 受體及 caspase-8，將凋亡信號傳遞至線粒體，加速細胞凋亡[16]；或者通過降低細胞超氧化物歧化酶活性，破壞細胞膜，導致細胞損傷[17]。也有研究發現柴胡皂苷D-黃芩苷配伍可使體內TLR4-NFκB 信號通路下調，降低炎癥，從而保護CCl4損傷的LO2 細胞[18]。可見，僅在柴胡皂苷D 這一單體與LO2 肝細胞關系上的研究結果就存在爭議。而LO2 細胞是目前用于保肝藥物篩選的常用細胞模型，很多中藥單體或提取物以該細胞為模型研究保肝作用[19-21]。因此本研究建立APAP 誘導LO2 細胞急性肝損傷模型對北柴胡水提液主要化學成分群活性進行比較。結果發現，柴胡皂苷F 及黃芩苷預給藥后，細胞存活率提高約1.5 倍，具有潛在肝損傷預保護作用。但體外實驗結果也表明，北柴胡水提液中化學成分復雜，各成分活性也具有雙向性，考慮柴胡藥效作用的發揮與體內吸收、代謝、排泄過程密切相關，是多個成分及其代謝產物綜合作用的結果，因此對其藥效及毒性的評價還是應以整體為單位，以全面闡明其代謝通路及效應機制。