香茅醛對心肌缺血/再灌注損傷大鼠的抗氧化保護作用

華瑞，王琦，張愉，付國強，姚家久*（.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院急診科，西安 70038；.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院內(nèi)分泌科，西安 70038）

急性心肌梗死具有發(fā)病快，致死、致殘率高等特點[1]，是急診中常見的危重癥，目前主要采用溶栓療法及其他心外科技術(shù)降低患者的病死率，而心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion，MI/R）損傷是心肌梗死的治療中十分常見的并發(fā)癥，中斷的血流突然恢復(fù)后會產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)（如心律失常、微循環(huán)障礙以及部分心肌細胞損傷進行性加重等[2-3]），仍然影響心臟功能，并給存活的患者帶來其他傷害。因此尋找安全、有效、可行的方法減少MI/R 損傷的發(fā)生，對于提高急性心肌梗死患者的預(yù)后和生活質(zhì)量具有重大的社會價值，也成為心血管領(lǐng)域的研究熱點。大量數(shù)據(jù)表明，氧化應(yīng)激是MI/R 損傷發(fā)生的重要機制之一[4-6]，具有抗氧化作用的藥物對預(yù)防MI/R 損傷效果良好。香茅醛（citronellal，3，7-二甲基-6-辛烯醛）是從植物檸檬香茅中提煉出來的一種無環(huán)單萜醛[7]，能顯著清除自由基，具有抗菌、抗驚厥、抗抑郁等作用[8]。香茅醛油可減少角叉菜膠誘導(dǎo)的中性粒細胞遷移并抑制髓過氧化物酶的釋放[9]。香茅醛和香葉醇（另一種單萜醇）均可通過調(diào)節(jié)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶來抑制 NO的產(chǎn)生，減少類固醇的釋放[10]，阻滯炎癥過程。香茅醛還可以降低高脂飲食誘發(fā)的氧化應(yīng)激，夠預(yù)防內(nèi)皮功能障礙并抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[11]。關(guān)于香茅醛在MI/R 損傷中的作用及其機制尚未見報道，考慮其具有揮發(fā)性香氣，可應(yīng)用于芳香療法，并且屬于天然物質(zhì)、安全性高，因此有望成為心血管急重癥治療中預(yù)防并發(fā)癥的新型手段，本研究旨在探索香茅醛對MI/R 損傷的保護作用及其機制，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

健康成年SD 雄性大鼠（SPF 級）50 只，體質(zhì)量為200 ～250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。所有大鼠在溫度、濕度適宜的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。實驗前隨機分為5 組，分別為假手術(shù)組，模型組，香茅醛低、中、高（50、100、150 mg·kg－1）劑量組，每組10 只。

1.2 試藥

香茅醛（CAS106-23-0，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，使用時用乙醇溶解）。血清乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、組織丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素氧化酶1（HO-1）（Abcam公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（博奧森生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 動物模型制備與處理

將大鼠給予異氟烷吸入麻醉，呈仰臥位固定，連接心電監(jiān)護儀并作氣管插管，連接于小動物呼吸機（頻率為5 次·min－1，潮氣量為10 mL·kg－1，呼吸比為1∶2）。沿胸骨左緣打開胸腔，暴露心臟冠狀動脈左前降支，在左心耳下方1 ～2 mm 處進針穿線，并將硅膠管沿絲線穿入至血管下，待血壓、呼吸穩(wěn)定后，輕輕結(jié)扎30 min，心電圖顯示ST 段抬高后，松開絲線恢復(fù)血流，持續(xù)120 min。假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎。參考文獻[11]及預(yù)實驗結(jié)果，香茅醛低、中、高給藥組分別以50、100、150 mg·kg－1的劑量于造模前1 周進行灌胃，每日1 次，連續(xù)7 d，假手術(shù)組和模型組灌胃等量含5%乙醇的生理鹽水。

2.2 組織病理學(xué)檢測

將各組心肌組織用10%中性福爾馬林固定過夜，脫水、石蠟包埋后切片，HE 染色，梯度脫水，封片，于20 倍光鏡顯微鏡下觀察。

2.3 心臟功能測定

分離大鼠右頸總動脈，將含0.1%肝素鈉的導(dǎo)管緩緩插入左心室，利用Power Lab 生物信號采集處理系統(tǒng)實時監(jiān)測大鼠左心室血流動力學(xué)的變化，評估心臟收縮及舒張功能。觀察指標(biāo)包括左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末期壓（LVEDP）、左心室等容期壓力最大變化速率（±dP/dtmax）。

2.4 心肌損傷標(biāo)志酶測定

復(fù)灌結(jié)束時，收集動脈血液至非抗凝管中，在4000 r·min－1、4℃條件下離心10 min，取上清液。按試劑盒操作步驟測定血清中LDH、CK-MB 活性。

2.5 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測

低溫環(huán)境下將心肌組織研磨成勻漿，以化學(xué)比色法檢測組織勻漿液中SOD、CAT 以及GSHPx 活性，硫代巴比妥酸法檢測MDA 含量，具體操作均遵循相關(guān)試劑盒說明書進行。

2.6 蛋白表達檢測

取50 mg 大鼠心肌組織，使用RIPA 裂解液冰浴中裂解組織提取總蛋白，并采用BCA 法檢測各組蛋白濃度。經(jīng)12.5%SDS-PAGE 膠電泳分離蛋白樣品后，采用半干轉(zhuǎn)裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，將膜用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉1 h，用TBST 洗凈殘余封閉液，分別加入Nrf2、HO-1 和GAPDH 的一抗，4℃孵育過夜，TBST 洗膜4 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再次洗膜4 次后用ECL 顯色液進行顯色，用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀拍攝圖像并進行分析。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Graphpad Prism 6.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以表示。多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），運用Dunnett’st檢驗比較兩組之間的差異，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 香茅醛對大鼠MI/R 后心肌組織形態(tài)的影響

HE 染色后觀察大鼠心肌組織，結(jié)果如圖1所示，假手術(shù)組大鼠心肌細胞形態(tài)較為規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整、排列有序；模型組大鼠存在明顯心肌纖維斷裂情況，伴隨大量炎性細胞浸潤，部分細胞壞死、細胞質(zhì)空泡化以及細胞外間隙增大等病理改變；香茅醛低劑量（50 mg·kg－1）組呈小灶性壞死，心肌細胞排列稀疏，橫紋模糊，心肌間質(zhì)中度腫脹，出現(xiàn)部分炎細胞浸潤；香茅醛中劑量（100 mg·kg－1）組心肌組織橫紋不清晰，心肌間質(zhì)輕度腫脹，可見少量炎細胞浸潤；香茅醛高劑量（150 mg·kg－1）組心肌細胞排列相對整齊，間質(zhì)炎性細胞浸潤明顯減少，水腫減輕，形態(tài)較正常。結(jié)果提示，香茅醛能顯著改善心肌組織病理損傷（見圖1）。

圖1 香茅醛對大鼠MI/R 后心肌組織形態(tài)的影響（×20）Fig 1 Effect of citronellal on the morphology of tmyocardial tissue in rats after MI/R（×20）

3.2 香茅醛對大鼠MI/R 后心臟功能的影響

如表1 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVSP 和＋dP/dtmax下降，LVEDP 和－dP/dtmax上升（P＜0.05），提示模型組大鼠心臟舒張功能和收縮功能明顯受損；與模型組比較，香茅醛中、高劑量組LVSP 升高，香茅醛高劑量組＋dP/dtmax升高，香茅醛高劑量組LVEDP 和－dP/dtmax顯著降低（P＜0.05），提示香茅醛預(yù)處理有改善MI/RI 后心肌收縮及舒張功能的作用。

表1 香茅醛對大鼠MI/R 后室血流動力學(xué)的影響 (x±s，n ＝10)Tab 1 Effect of citronellal on the hemodynamics in rats after MI/R (x ±s，n ＝10)

3.3 香茅醛對大鼠MI/R 后心肌損傷標(biāo)志酶的影響

如表2 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清LDH、CK-MB 活性均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，香茅醛各劑量組血清LDH、CK-MB 的活性均降低（P＜0.05），提示香茅醛能減輕心肌細胞膜的損傷，降低心肌酶的漏出。

表2 香茅醛對大鼠MI/R 后血清LDH、CK-MB 的影響(x±s，n ＝10)Tab 2 Effect of citronellal on the levels of LDH and CK-MB in rats after MI/R (x±s，n ＝10)

3.4 香茅醛對大鼠MI/R 后氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

如表3 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織MDA 水平顯著升高，而SOD、CAT 和GSH-Px 活性均顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，香茅醛中、高劑量組大鼠心肌組織MDA水平顯著降低，而SOD、CAT 和GSH-Px 水平均顯著升高（P＜0.05），提示香茅醛可以提高心肌組織的抗氧化能力。

表3 香茅醛對大鼠MI/R 后心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 (x±s，n ＝10)Tab 3 Effect of citronellal on the oxidative stress indicators in rats after MI/R (x ±s，n ＝10)

3.5 香茅醛對大鼠MI/R 后抗氧化信號分子的影響

如圖2 所示，與假手術(shù)組比較，MI/R 模型組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白水平應(yīng)激性略有升高；與模型組比較，香茅醛中、高劑量組Nrf2 和HO-1 蛋白水平升高（P＜0.05）。

圖2 香茅醛對大鼠MI/R 后抗氧化信號的影響Fig 2 Effect of citronellal on the antioxidant signaling after MI/R

4 討論

MI/R 損傷常伴隨出現(xiàn)心律失常、心臟功能紊亂，心肌損傷標(biāo)志酶活性升高，心肌細胞內(nèi)活性氧自由基產(chǎn)生等改變，最終導(dǎo)致心肌細胞壞死等不可逆的心肌損傷[3]。研究表明，香茅醛具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)功能[12-13]，在糖尿病心肌病與動脈粥樣硬化的大鼠模型中都被證明能夠抑制氧化應(yīng)激，減少心肌損傷，改善血管內(nèi)皮功能障礙[11，14]。

MI/R 損傷程度與心臟功能密切相關(guān)，血流動力學(xué)指標(biāo)LVSP、LVEDP、±dP/dtmax是反應(yīng)心臟收縮和舒張功能的重要指標(biāo)[15]，本實驗結(jié)果提示香茅醛可減少因缺血再灌注引起的心肌收縮與舒張功能障礙，尤其以改善心舒期功能為主。LDH對于機體能量代謝非常重要，主要催化乳酸脫氫后生成丙酮酸，在心肌組織中含量最高[16]。肌酸激酶（CK）與細胞內(nèi)能量運輸、肌肉收縮和ATP再生直接相關(guān)，催化肌酸和ATP 之間的轉(zhuǎn)磷酸化反應(yīng)[17]，在臨床診斷中經(jīng)常測定血清中其同工酶CK-MB 水平以反映肌肉萎縮或心肌梗死等病變。通過測定LDH 與CK-MB 活性可判斷心肌細胞的損傷程度，本實驗結(jié)果顯示香茅醛能降低再灌注時血清中LDH 與CK-MB 的活性，進一步提示香茅醛很可能通過改善能量代謝而降低心肌細胞損傷。

研究表明，增強抗氧化能力可逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激造成的心肌細胞與血管內(nèi)皮組織的損傷，從而延緩或阻止MI/R 損傷的發(fā)生和發(fā)展[18-20]。通過檢測組織中細胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)主要終產(chǎn)物MDA 的水平可直接反映其氧化程度，MI/R 等損傷因素誘發(fā)產(chǎn)生的大量超氧陰離子自由基會被SOD 轉(zhuǎn)化為H2O2，繼而H2O2在CAT 與GSH-Px 的作用下被催化生成H2O 和O2，從而減少氧化應(yīng)激誘發(fā)的自由基連鎖損傷，達到保護心肌的效果[21-22]。本實驗中香茅醛可明顯降低MDA 含量，并升高SOD、CAT及GSH-Px 水平，提示香茅醛可增強心肌組織的抗氧化能力，減少MI/R 誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷，進而發(fā)揮對心肌的保護作用。當(dāng)機體受到外界刺激時，會應(yīng)激性地啟動以Nrf2 為核心的內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，而天然存在的抗氧化物質(zhì)（如酚類化合物）也會通過重要的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 促進抗氧化反應(yīng)元件（ARE）的活化[23-24]，參與多種抗氧化酶基因如HO-1、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的調(diào)控，從而發(fā)揮抗氧化作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生MI/R 時，Nrf2 與其下游HO-1 蛋白會應(yīng)激性升高，給予中、高劑量的香茅醛干預(yù)后，兩種抗氧化關(guān)鍵蛋白均顯著升高，說明香茅醛可能通過Nrf2/HO-1 途徑發(fā)揮抗氧化作用。

綜上，香茅醛對MI/R 損傷有明顯的保護作用。這種保護作用可能與香茅醛改善缺血/再灌注后心肌收縮與舒張功能，增強清除氧自由基能力，降低過氧化物的生成，減少氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，但其詳細作用機制有待進一步研究。