基于UPLC-Q-Exactive Focus-MS/MS技術分析飛蛾藤中的化學成分

王小彤，胡靜，任慧，崔小敏，曲彤，李寧，吳靳榮*，陳志永*（.上海中醫藥大學中藥學院，上海 003；.陜西省中醫藥研究院，西安 70003）

旋花科飛蛾藤屬植物在全世界有約20 余種，主要分布于亞洲熱帶及亞熱帶，非洲及鄰近島嶼、大洋洲、美洲也存在少量分布。我國飛蛾藤屬植物資源豐富，有14 種，8 個變種，主產云南，部分種分布于長江以南各省，1 種延伸至陜西、甘肅[1]。飛蛾藤屬植物有廣泛的藥用記載，如大果飛蛾藤P.sinensis已成為商品丁公藤藥材的主流替代品種[2]；美飛蛾藤P.spectabilis在廣西民間以全草入藥，用于治療子宮脫垂[3]；小萼飛蛾藤P.mairei據《中華本草》記載，以根入藥，有鎮咳平喘的功效[4]。然而，我國法定藥品質量標準體系至今尚未收載任何飛蛾藤屬植物。

飛蛾藤（Porana racemosaRoxb．）據《全國中草藥匯編》記載，以全草入藥，具發表、消食積之功效，主治傷風感冒、食積不消[5]；在湖南民間，俗稱黃烏龍，用于治療風濕病[6]?，F代研究表明，飛蛾藤還具有抗風濕、抗炎、抑制前列腺素和白三烯生物合成等作用，可治療風濕病及神經疼痛[7]。目前有關飛蛾藤化學成分的研究較少，雖有少數研究表明飛蛾藤中含有機酸類、香豆素類、黃酮類、甾醇類等化合物[7]，卻缺乏系統性研究。本試驗采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道離子阱聯用質譜（UPLC-Q-Exactive Focus-MS/MS）技術，對飛蛾藤全草中化學成分進行全面、快速的定性分析，以期為飛蛾藤的藥效物質基礎及質量控制研究提供依據。

1 材料

UPLC-Q-Exactive Focus-MS/MS 型高分辨質譜儀，UltiMate 3000 型超高效液相色譜系統（ThermoFisher Scientific 公司），BT25S 型0.01 mg 電子分析天平及BS210S 型0.1 mg 電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]，KQ-100 型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。飛蛾藤藥材分別于2020年7月采集于云南文山，2020年9月采集于云南昆明，2020年10月采集于湖北恩施，干燥后保存待用，藥材經陜西省中醫藥研究院陳志永副研究員鑒定為飛蛾藤，樣品保存于陜西省中醫藥研究院中藥所中藥化學室。東莨菪苷（批號：16040805）、東莨菪內酯（批號：161208）、綠原酸（批號：1701904）、新綠原酸（批號：17062003）、異綠原酸A（批號：19061201）、異綠原酸B（批號：17121201）、異綠原酸C（批號：18070401）、傘形花內酯（批號：18010202）和咖啡酸（批號：17122804）（對照品，上海圻明生物科技有限公司，純度≥98%），水為屈臣氏蒸餾水，甲醇、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

飛蛾藤藥材干燥后打粉，過40 目篩，精密稱取樣品粉末0.5 g，置100 mL 具塞錐形瓶中。精密加80%甲醇50 mL，稱重后常溫下超聲提取30 min（頻率40 kHz，功率100 W），靜置冷卻至室溫，用80%甲醇補足質量損失，搖勻，過濾，取續濾液5 mL 轉移至10 mL 量瓶中，加入80%甲醇定容至刻度，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取東莨菪苷、東莨菪內酯、傘形花內酯、咖啡酸、綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 對照品適量，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，制備單一對照品儲備液，各單一對照品儲備液混合并稀釋得混合對照品溶液，均置于冰箱中4℃保存。

2.3 色譜條件

Thermo Accucore aQ C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，2.6 μm），流動相甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脫（0 ～12 min，5%～25%A；12 ～20 min，25% ～30%A；20 ～28 min，30% ～38%A；28 ～40 min，38% ～50%A；40～55 min，50%～60%A），流速0.3 mL·min－1，柱溫30℃，進樣量3 μL。

2.4 質譜條件

高性能加熱電噴霧離子源（HESI），正、負離子檢測模式，噴霧電壓3.5 kV，毛細管溫度350℃，霧化室溫度320℃，鞘氣流速45 arb，輔助氣流速15 arb，掃描模式為Full MS/dd-MS，Full MS 分辨率70 000，dd-MS 分辨率17 500，掃描范圍為m/z80 ～1200。MS/MS 模式時所用碰撞能量為30 eV。

2.5 數據處理

取飛蛾藤樣品溶液及對照品溶液適量，進樣分析，根據Xcalibur 2.0 軟件計算出高分辨精確質量數，與自建飛蛾藤化學成分數據庫進行匹配，按照實際測得的相對分子質量與理論相對分子質量兩者偏差＜5×10－6的原則對目標化合物進行初步快速鑒定，推測色譜峰相對應的化合物分子式，再通過二級碎片的信息、相關文獻及與對照品比較，確認并推導出化合物的結構及裂解規律。

3 結果與分析

飛蛾藤在正離子模式和負離子模式下的總離子流圖見圖1。通過對飛蛾藤化合物一級、二級質譜裂解規律的分析，最終共鑒定出30 個化合物，包括有機酸類13 個、香豆素類5 個、酰胺類4 個、黃酮類3 個及其他類5 個，其中9 個成分通過與對照品比對后確認。化合物保留時間、分子式、分子質量、一級質譜及二級質譜碎片離子具體見表1。

表1 飛蛾藤中化學成分的UPLC-Q-Exactive Focus-MS/MS 鑒定Tab 1 Identification of chemical constituents in Porana racemosa by UPLC-Q-Exactive Focus-MS/MS

圖1 飛蛾藤在正離子（A）和負離子（B）模式下的總離子流及部分化合物的提取離子流圖Fig 1 Total ion chromatograms of Porana racemosa in both positive（A）and negative（B）ion modes and extracted ion chromatograms of some compounds

3.1 有機酸類

從飛蛾藤中共鑒定出13 種有機酸類的化合物，包括苯丙素類4 個，分別為化合物2、7、9、17；綠原酸類衍生物共8 個，分別為化合物3、8、11、13、15、21、22、30，以及有機酸類的衍生物化合物18。

簡單苯丙素類化合物中多含羥基、糖基，且較多化合物為中藥中的有效成分。負離子模式下化合物2 分子離子峰為153.0195 [M-H]－，二級碎片推測其裂解途徑為母離子丟掉1 個羧基，得到碎片離子109.0295 [M-H-COO]－，根據文獻[8]報道飛蛾藤近似種屬植物中含有龍膽酸，并結合質譜相關文獻[9]，推測化合物2 為龍膽酸?；衔? 的準分子離子峰為179.0350 [M-H]－，化學結構為C9H8O4，二級質譜中失去1 個羧基得到咖啡酸的特征碎片離子135.0453 [M-H-COO]－，參考相關文獻[10]及對照品質譜行為，鑒定化合物9 為咖啡酸?；衔? 和咖啡酸為一對同分異構體，由于咖啡酸中苯環上存在鄰位酚羥基，易形成氫鍵，極性相較于化合物7 偏小，保留時間靠后，且其二級質譜中存在碎片離子71.0138 [M-HC6H4O2]－，59.0138 [M-H-C6H4O2-C]－，結合文獻報道[11]，推測化合物7 為3，5-二羥基肉桂酸。正離子模式下，化合物17 的準分子離子峰為179.0706 [M ＋H]＋，高能撞擊后產生的二級碎片離子，得到碎片離子161.0596，參考文獻[12]后推測此成分為4-甲氧基肉桂酸。

綠原酸類衍生物具有明顯的抗氧化及抗炎作用[13]，飛蛾藤提取物中共鑒定出8 種此類型化合物，且多為同分異構體。新綠原酸和綠原酸在負離子模式下分子離子峰分別為353.0879 [MH]－，353.0881 [M-H]－，由于兩者均由咖啡酸和奎寧酸酯化形成，僅連接位置存在差異，因此裂解方式相似。以新綠原酸為例，二級質譜中母離子分別失去咖啡酸部分和奎寧酸部分得到特征碎片179.0349 [M-H-C7H10O5]－及191.0562 [M-HC9H6O3]－，進一步失去1 個H2O 得到特征碎片161.0240 [M-H-C7H10O5-H2O]－，173.0454 [M-HC9H6O3-H2O]－；或在179 碎片離子上繼續失去1 個CO2得到特征碎片135.0452 [M-H-C7H10O5-CO2]－。結合新綠原酸、綠原酸對照品的質譜行為、成分性質及相關文獻，鑒定出化合物3、8 分別為新綠原酸和綠原酸。具體推測的化合物裂解方式見圖2。化合物11 的準分子離子峰及碎片離子峰與綠原酸基本吻合，推測化合物11 為綠原酸的同分異構體。此外，還通過對照品比較鑒定出化合物21、22、30 這3 個同分異構體，分別為異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C。以異綠原酸A的質譜為例，一級質譜中分子離子峰為515.1198[M-H]－，在高能碰撞下其酯鍵斷裂，失去1 個肉桂酸酯，得到碎片離子353.0878 [M-H-C9H6O3]－，接著與單咖啡?？崴岬牧呀馔緩较嗨?，開環后得到碎片離子179.0349 [M-H-C9H6O3-C7H10O5]－，并繼續丟失1 個CO2，得到碎片離子135.0452[M-H-C9H6O3-C7H10O5-CO2]－； 或353.0878 碎片離子的酯鍵斷裂，得到碎片離子191.0562 [M-HC9H6O3-C9H6O3]－。

圖2 新綠原酸負離子模式下的二級質譜圖及裂解途徑Fig 2 MS2 spectrum and fragmentation pathways of 5-O-caffeoylquinic acid at negative ion mode

化合物13 在負離子模式下，分子離子峰為367.1021 [M-H]－，二級質譜中，存在191.0562，173.0454，134.0373 等碎片離子，化合物15 與化合物13 的一級與二級質譜行為均高度相似，且兩者都與綠原酸的裂解途徑基本相似，參考質譜裂解文獻[14]，推測這兩個化合物為綠原酸甲酯或4-O-綠原酸甲酯?；衔?8 在負離子模式下一級質譜中分子離子峰為193.0506 [M-H]－，二級質譜中，能量撞擊后丟掉1 個甲酯，得到134.0372[M-H-COOCH3]－碎片離子，接著失去CH4O2得到苯環碎片離子74.0247 [M-H-COOCH3-C2H4O2]－，結合文獻[15]，推測化合物18 為咖啡酸甲酯。

3.2 香豆素類

從飛蛾藤中共鑒定出5 種香豆素類化合物，分別為化合物5、6、12、14、23，其中化合物5、12、14 經與對照品比較后鑒定為東莨菪苷、傘形花內酯、東莨菪內酯。香豆素類化合物具有相同母核，母離子裂解過程中，主要丟失CO、CH3等基團，例如化合物5 在正離子模式下準分子離子峰為355.1024 [M ＋H]＋，其對應分子式為C16H18O9，二級質譜中失去1 分子葡萄糖殘基，產生碎片離子193.0496 [M ＋H-C6H10O6]＋，再失去1 個CO3，得到碎片離子133.0282 [M ＋H-C6H10O6-CO3]＋；或失去1 個甲基，得到碎片離子178.0258 [M ＋H-C6H10O6-CH3]＋；或直接失去1 個中性碎片CO，獲得碎片離子165.0547 [M ＋H-C6H10O6-CO]＋，結合文獻[16]參考，并與對照品的保留時間及質譜碎片相比較，鑒定該化合物為東莨菪苷。同樣在正離子模式下，化合物6 與化合物14 為一對同分異構體，兩者主要區別在羥基及甲氧基于C-6，C-7 的位置異構。兩個化合物準分子離子峰均為193.0496 [M ＋H]＋，推測化學式為C10H8O4，裂解方式基本一致，二級質譜中碎片離子均存在178.0258 [M ＋H-CH3]＋，133.0284 [M ＋H-CO3]＋，結合文獻參考[16]，推測化合物6 為異東莨菪內酯，同時與對照品的保留時間及碎片離子相比較，鑒定化合物14 為東莨菪內酯，推測此化合物可能的裂解途徑見圖3。化合物23 一級質譜中準分子離子峰為517.1345 [M ＋H]＋，推測對應分子式為C25H24O12，根據其二級質譜中香豆素的特征碎片163.0389 [M ＋H-CH2O-C15H16O8]＋，結合此成分的相關研究[17-18]，推測此化合物為7-O-[4'-O-（3''，4''-dihydroxycinnamyl）-β-D-glucopyranosyl]-6-methoxycoumarin。負離子模式下，化合物12準分子離子峰為161.0244 [M-H]－，對應分子式C9H6O3，二級質譜中丟失1 個羰基或1 個羧基，分別得到碎片離子133.0294 [M-H-CO]－，117.0344 [M-H-COO]－。相同質譜條件下，此化合物與具有傘型花內酯母核的化合物5、6、14二級碎片裂解方式存在吻合，結合對照品及相關文獻[19]，鑒定此化合物為傘形花內酯。

圖3 東莨菪內酯正離子模式下的二級質譜圖及裂解途徑Fig 3 MS2 spectrum and fragmentation pathways of scopoline at positive ion mode

3.3 酰胺類

從飛蛾藤中鑒定出酰胺類化合物4 個，分別為化合物19、20、27、28，其中化合物19 與27、20 與28 分別為同分異構體。負離子模式下，化合物19 分子離子峰為282.1136 [M-H]－，化合物27 分子離子峰為282.1135 [M-H]－，對應化合物分子式為C17H17O3N，化合物19 的極性相較于化合物27 更大，初步推測化合物19 為N-反式-對香豆酰酪胺，化合物27 為（E）-N-2-（2，3-二羥基苯基）乙基肉桂酰胺?；衔?9 的二級質譜中，282.1136 [M-H]－失去C8H8O，得到香豆酰胺部分的碎片離子162.0562 [M-H-C8H8O]－，162碎片離子繼續失去1 個酰胺基團得到特征碎片離子119.0502 [M-H-C8H8O-CONH]－?；衔?7 的二級質譜中282.1135 [M-H]－直接丟失C8H9O2，得到肉桂酰胺部分碎片離子145.0296 [M-HC8H9O2]－，或在162 碎片基礎上繼續丟失1 個酰胺基團得到特征碎片離子119.0501 [M-H-C8H9O2-CONH]－。結合相關文獻[20-22]，推測化合物19 為N-反式-對香豆酰基酪胺，化合物27 為（E）-N-2-（2，3-二羥基苯基）乙基肉桂酰胺?；衔?9可能裂解途徑見圖4。

圖4 N-反式-對香豆?；野坟撾x子模式下的二級質譜圖及裂解途徑Fig 4 MS2 spectrum and fragmentation pathways of N-transcoumaroyltyramine at negative ion mode

正離子模式下，化合物20 與28 分別推測為N-順式-對羥基苯乙基阿魏酰酪胺、N-反式-對羥基苯乙基阿魏酰酪胺。其中以N-順式-對羥基苯乙基阿魏酰酪胺為例，其準分子離子峰為314.1384 [M ＋H]＋，碎片離子峰存在母離子直接丟失基團得到的177.0546 [M ＋H-C8H9O2]＋或121.0648 [M ＋H-C10H11O3N]＋，參考本團隊此前對光葉丁公藤的研究[14]，結合質譜行為及保留時間，推斷化合物20為N-順式-對羥基苯乙基阿魏酰酪胺，化合物28為N-反式-對羥基苯乙基阿魏酰酪胺。

3.4 黃酮類

黃酮類化合物結構特征明顯，質譜特征較強，易產生甲基、羧基、糖苷等碎片離子峰。本研究共從飛蛾藤提取物中鑒定出3 個黃酮類成分，其中化合物24 在負離子模式下，準分子離子峰為463.0083 [M-H]－，推測化合物分子式為C21H20O12，二級質譜中此化合物連續失去1 個吡喃葡萄糖，1 個氫離子，1 個醛基，1 個氧離子，分別得到特征離子301.0342 [M-H-C6H10O5]－，300.0276 [M-H-C6H10O5-H]－，271.0248 [M-HC6H10O5-H-COH]－，255.0298 [M-H-C6H10O5-HCOH-O]－；或2-苯基色原酮部分發生Retro Diels-Alder 反應，C 環裂解得到特征離子151.0037[M-H-C6H10O5-C8H6O3]－，結合相關文獻[23-24]，推測化合物24 為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，相關裂解途徑見圖5。此外，化合物25 與化合物24 母核相同，在負離子模式下二級質譜中先失去1 分子蕓香糖，得到碎片離子301.0341 [M-Hrutulosyl]－，其后續裂解途徑與化合物24 相似，根據文獻參考[25]后，推測化合物25 為蘆丁?；衔?6 與化合物24 及25 的裂解方式相似，根據其分子離子峰303.0499 [M ＋H]＋，碎片離子峰285.0387 [M ＋H-H2O]＋，153.0184 [M ＋H-C8H6O3]＋，同時參考色譜行為及相關文獻[26]，推測其為槲皮素。

圖5 槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷負離子模式下的二級質譜圖及裂解途徑Fig 5 MS2 spectrum and fragmentation pathways of quercetin-3-O-β-Dglucopyranoside at negative ion mode

3.5 其他類

化合物1 為生物堿類，因此采用響應較好的正離子模式，其準分子離子峰為144.1019 [M ＋H]＋，推測其分子式為C7H13NO2，通過高能碰撞后得到二級質譜中各碎片離子，包括丟失1 個H2O 的碎片離子126.0914 [M ＋H-H2O]＋；或直接丟失C2H6O 得到的碎片離子98.0600 [M ＋H-C2H6O]＋，繼續失去1 個甲基得到的碎片離子84.0808 [M ＋H-C2H6O-CH2]＋，根據相關文獻報道推測其為包公藤丙素或凹脈丁公藤堿[27]，但兩者為同分異構體，色譜柱保留時間，裂解方式相似，無法完全根據現有信息區分，因此推測化合物1 為包公藤丙素或凹脈丁公藤堿?；衔? 為糖苷類化合物，在負離子模式下，一級質譜出現分子離子峰359.0992 [M-H]－，推測對應結構式為C15H20O10，二級質譜中失去1 個葡萄糖殘基得到碎片離子197.0456 [M-H-C6H10O5]－后，苷元部分與丁香酸的裂解途徑相似，分別連續失去甲基、COH、甲基，產生碎片離子182.0219 [M-HC6H10O5-CH3]－，153.0556 [M-H-C6H10O5-CH3-COH]－，138.0323 [M-H-C6H10O5-CH3-COH-CH3]－，結合文獻[28-29]，推測其為丁香酸葡萄糖苷?；衔?0 為醇類化合物，在正離子模式下，其一級質譜的準分子離子峰為165.0759 [M ＋H]＋，推測其對應化合物分子式C6H12O5，二級質譜碎片存在環烷烴的特征碎片簇峰165.0759 [M ＋H]＋，164.0284 [M ＋H-H]＋，120.0197 [M ＋H-C2H5O]＋，119.0189 [M ＋H-H-C2H5O]＋， 或105.9347 [M ＋H-C2H4O2]＋，104.9634 [M ＋H-HC2H4O2]＋，化合物16與化合物10質譜行為基本相同，結合飛蛾藤屬有關報道[11]，推測化合物10或16 為1β，2β，3α，4β，5α-cyclohexanepentol或其同分異構體?；衔?9 為木脂素類化合物，根據其負離子模式下的質譜行為可知，其一級質譜中分子離子峰為745.2682 [M-H]－，二級質譜中連續丟失C7H7O2、C3H5O2、glucopyranosyl 得到碎片峰387.1433 [M-H-C7H7O2-glucopyranosyl-C3H5O2]－，繼續丟失1個H2O 得到369.1343 [M-HC7H7O2-glucopyranosyl-C3H5O2-H2O]－， 結合文獻[30]推測此化合物為4-{erythro-2-[3-（4-hydroxyl-3-methoxyphenyl）-3-O-β-D-glucopyranosyl-propan-1-ol}-O-medioresinol。

4 討論

本研究中目標化合物存在較多的同分異構體，如有機酸中的綠原酸及新綠原酸，香豆素中的東莨菪苷及異東莨菪苷，生物堿中的包公藤丙素或凹脈丁公藤堿。由于高分辨質譜技術在一些同分異構體構型指認上的局限性，通常需結合其他信息進行區分。大多根據不同類型化合物的裂解方式進行初步區分，但飛蛾藤中的同分異構體多為同類型或相同母核，裂解方式相似，因此需結合色譜行為、參考文獻區分出峰順序，或根據相關報道的保留時間進行推測鑒定，部分同分異構體核對對照品進一步確認。這些同分異構體化合物的發現，在豐富飛蛾藤成分的同時也給各成分的定性增加了難度。

本研究從飛蛾藤中共鑒定出30 個化合物，包含有機酸類、香豆素類、酰胺類、黃酮類和其他類，其中7 個化合物為飛蛾藤屬中首次報道。新報道的化合物中，咖啡酸、綠原酸甲酯及咖啡酸甲酯均為有機酸類的衍生物，具備良好的生物活性，其中咖啡酸可通過降低促炎因子的活性起到抗炎作用，其有機酯衍生物也具有潛在藥理活性[31-32]；甲酯化綠原酸衍生物能夠抑制巨噬細胞RAW 264.7 中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的分泌，抗炎活性強于綠原酸[33]；N-順式-對羥基苯乙基阿魏酰酪胺及N-反式-對羥基苯乙基阿魏酰酪胺此類酰胺類生物堿對NO 的釋放均有不同程度的抑制作用[34]。這些活性成分的發現可為飛蛾藤藥效物質基礎及質量控制的研究提供參考。

本研究利用UPLC-Q-Exactive Focus-MS/MS技術具有高靈敏度、高質量精度、高分辨率等特點，結合現有關于飛蛾藤中已報道的成分，建立了一種快速分析鑒定飛蛾藤中化學成分的方法。結果表明有機酸類、香豆素類、黃酮類、酰胺類成分在飛蛾藤中含量豐富，且因各類型成分性質、結構差異，呈現出多數成分在負離子模式現響應更好的現象。除此以外，正離子模式下存在1 個，負離子模式下存在2 個響應度較高的化合物未推測鑒定出，表明飛蛾藤中尚有大量未知成分需要進行系統地植物化學分離、鑒定。