芪苓益腎顆粒傳統制備方法與配方顆粒的指紋圖譜差異性研究

王隆隆，賈慶涵，袁會瑩，張海風，陳恒文，杜躍亮，楊忠杰，王韻旨，寧萌，于曉濤*

（1.漯河市中心醫院，河南 漯河 462300；2.漯河市第二人民醫院，河南 漯河 462300；3.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100000）

“芪苓益腎顆粒”是本院腎病科醫師依據經典名方“當歸補血湯”在長期臨床應用中形成的經驗方，全方由黃芪、當歸、茯苓、枸杞子4 味藥組成，主要用于氣血兩虧，脾腎不足所致的頭暈目眩，面色萎黃，食少納差，氣短無力，病后體虛，腫瘤化療后白細胞減少，慢性腎功能不全，蛋白尿等癥。

中藥配方顆粒（Chinese medicine formula granule，CFG）是指運用現代技術以單味中藥為基礎進行提取、濃縮、制粒、分裝等工藝制成的一種粉末或顆粒狀制劑。CFG 保留了傳統制備工藝制劑（traditional preparation process，TPP）隨癥加減的優勢，解決了傳統制劑不易攜帶、保存等問題[1-3]。CFG 研制成功以來，得到了快速發展，但尚未有統一的質量標準，造成CFG 質量參差不齊，嚴重限制了CFG 的臨床應用[4]；CFG與TPP 的物質基礎差異及臨床應用等效性是近年來的研究熱點和重點[5-7]。

本研究采用指紋圖譜結合化學模式識別法，定性和定量相結合，比較芪苓益腎顆粒TPP 與CFG 的差異，研究兩者化學成分種類和量的差異，為CFG 臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20AD 高效液相色譜儀（包括二元泵，全波長紫外檢測器，柱溫箱，自動進樣器，工作站）；SB25-12D 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；FW-80 型微型高速萬能試樣粉碎機（天津市工興電器廠）；AUW-120D 型十萬分之一電子天平（日本SHIMADZU 公司）；Milli-Q 超純水機（美國Millipore 公司）；5810R高速離心機（美國Eppendorf 公司）。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：111920-201606，純度：97.6%）、阿魏酸（批號：110773-201614，純度：99.0%）（對照品，中國食品藥品檢定研究院），芒柄花苷（批號：DSTDC004401，純度：98.99%）、毛蕊異黃酮（批號：DST-18120901，純度：99.84%）、芒柄花素（批號：DST-19033005，純度：99.03%）（對照品，成都德思特生物科技有限公司）；乙腈、甲醇均為色譜純（美國Fisher 公司）；磷酸為色譜純（天津科密歐化學試劑有限公司）；水為飲用水或超純水。

制備芪苓益腎顆粒所用中藥飲片具體信息如下：黃芪（產地甘肅，批號：20201001、20201101、20201201、200301、200701），當歸（產地甘肅，批號：20190201、20190401、20190701、200701、201201）， 茯苓（產地云南， 批號：20190301、20190401、20190501、20190701、20191101），枸杞子（產地寧夏，批號：2019301、20190730、20191008、200501、201101），所有飲片購于漯河市2 家藥店及1 家藥業公司。經河南中醫藥大學苗明三教授教授鑒定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus mongholicusBunge）的干燥根；當歸為傘形科植物當歸（Angelica sinensis）的干燥根，茯苓為多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf]的干燥菌核，枸杞子茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果實。

制備芪苓益腎顆粒所用配方顆粒信息如下：黃芪（A 廠3 批：20081321、20111011、20120601，B 廠3 批：2006004C、2008003C、2009003C，C廠3 批：0121993、0102733、0110163）、當歸（A廠3 批：20111071、20121201、21011501，B 廠3 批：2011030W、2012010W、2012020W，C 廠3 批，0103203、0110253、0120813）、茯苓（A廠3 批：20101141、20101161、20111121，B 廠3 批，2101001C、2102003W、2103002C，C 廠3批：0110753、0123273、0123283）、枸杞子（A 廠3 批：20080291、20091001、20091401，B 廠3 批：2005002W、2009001W、2101001W，C 廠3 批：0061023、0077063、0121343），以上配方顆粒購于漯河市4 家醫院及鄭州市2 家醫院。

2 方法

2.1 色譜條件

采用Phenomenex Gemini C18110 ?，LC（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以（0.05%磷酸-水）（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫（0 ～10 min，10%B；10 ～55 min，10% ～60%B；55 ～70 min，60%B；70 ～71 min，60%～10%B；71 ～85 min，10%B），柱溫35℃，進樣量10 μL，流速1 mL·min－1，檢測波長230 nm[8-12]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品適量，加甲醇制成質量濃度為1.86、1.92、2.14、2.02、1.96 mg·mL－1的對照品儲備液；精密量取各儲備液適量，混勻，制得含毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素各237.16、71.54、68.04、77.21、48.16 μg·mL－1的混合對照品溶液，密封保存。

2.2.2 樣品制備 取中藥飲片，依據芪苓益腎顆粒處方量隨機配伍組合，按工藝方法（因該處方正處于申報階段，故工藝參數暫時保密）制備芪苓益腎顆粒，得10 批TPP 樣品（S1 ～S10），為干燥細粉。

取中藥配方顆粒，按照A、B、C 3 個廠家分為3 組，每組隨機配伍6 份。根據芪苓益腎顆粒處方中飲片用量，取中藥配方顆粒適量，混勻，得18 批CFG 樣品（S11 ～S28）。

2.2.3 供試品溶液制備 取“2.2.2”項下5 g TPP樣品及相當于5 g TPP 樣品的CFG 樣品，置于100 mL 具塞錐形瓶中，加50 mL 熱水（80℃）溶解。待樣品充分溶解，取樣品液1 mL，加等量甲醇，振蕩后13 000 r·min－1離心3 min，取上清液為供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 參照“2.2.2”項下傳統制備方法，分別制備黃芪、當歸、茯苓、枸杞子的陰性樣品細粉，并依據“2.2.3”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法學驗證

2.3.1 精密度試驗 取S1 供試品適量，按“2.1”項下色譜方法，連續進樣6 次，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD均≤1.1%，各色譜峰相對峰面積RSD均≤1.8%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取S1 樣品適量，平行制備供試品溶液6 份，按“2.1”項下色譜方法測定，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，得到各共有峰的相對保留時間的RSD均≤1.0%，各色譜峰相對峰面積的RSD均≤1.5%，表明方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取S1 供試品適量，按“2.1”項下色譜方法，分別在0、3、9、24、48 h 測定，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，得各共有峰的相對保留時間的RSD均≤1.1%，各色譜峰相對峰面積的RSD均≤1.9%，表明供試品在至少48 h 內穩定。

2.3.4 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液，用甲醇稀釋成不同質量濃度的系列混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜方法進樣，記錄峰面積。以質量濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），進行線性擬合，結果見表1。

表1 各化學成分的回歸方程、相關系數和線性范圍Tab 1 Regression equation，correlation coefficient and linearity

2.3.5 加樣回收試驗 取含量已知S1 樣品細粉適量，均分為9 份，按各成分質量濃度的50%、100%、150%分別精密加入“2.2.1”項下混合對照品儲備液，各3 份，按“2.2.3”項下方法制備供試品液，進樣測定，計算各成分回收率及RSD。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的平均回收率在99.67%～101.82%，RSD均小于2.1%，說明方法準確可靠。

2.4 指紋圖譜的建立與研究

2.4.1 TPP 指紋圖譜的建立與共有峰確定 按“2.2.2”及“2.2.3”項下方法制備TPP 供試品10批（S1 ～S10），進樣測定，記錄色譜圖，建立TPP 的指紋圖譜。結果10 批TPP 供試品共標定21 個共有峰，見圖1。

圖1 TPP 指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）Fig 1 10 batches of TPP fingerprints and control fingerprints（R）

2.4.2 CFG 指紋圖譜的建立與共有峰確定 按“2.2.2”及“2.2.3”項下方法制備CFG 供試品A 廠（S11 ～S16）、B 廠（S17 ～S22）、C 廠（S23 ～S28）共18 批，進樣測定，記錄色譜圖，建立CFG 的指紋圖譜。結果18 批CFG 供試品共標定21 個共有峰，見圖2。

圖2 CFG 指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）Fig 2 TPP fingerprint and control fingerprint（R）

2.4.3 共有峰歸屬與化學成分指認 取混合對照品溶液、供試品溶液（S1）及各陰性樣品溶液適量，按“2.1”項下色譜方法進樣，記錄色譜圖。通過對對照品（S6）、陰性樣品（S2 ～S5）及供試品色譜圖（S1）比較，共指認18 個色譜峰，分別為峰6、峰11（阿魏酸）、峰13 及峰16 歸屬于當歸，峰1、峰3、峰9 及峰12 歸屬于茯苓，峰5 歸屬于枸杞子，峰2、峰10（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、峰14 ～15、峰17（芒柄花苷）、峰18（毛蕊異黃酮）、峰19（芒柄花素）、峰20 及峰21 歸屬于黃芪（見圖3）。

圖3 共有峰歸屬與化學成分指認圖Fig 3 Common peak attribution and chemical composition identification

2.5 指紋圖譜比較

2.5.1 化學成分種類和數目比較 通過指紋圖譜比較，TPP 中峰14，在CFG 中未發現；CFG 中有峰22，TPP 樣品中未發現，這可能與中藥混合共煎過程中化學成分間的絡合、氧化、分解、成鹽等反應有關[13]。

2.5.2 相對保留時間及相對峰面積 以峰10（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）為參照峰，分別計算10 批TPP、18 批CFG 色譜圖中20 個共有峰（峰1 ～13，峰15 ～21）的相對保留時間和相對峰面積。結果，28 批芪苓益腎顆粒中各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.5%，表明所有批次中各共有峰出峰時間較穩定；20 個共有峰相對峰面積的RSD在24.65%～68.05%，說明批次間樣品相對峰面積存在差異，且峰18、峰11、峰3 及峰1 的RSD差異較大。

2.5.3 共有峰總峰面積比較 以TPP 及CFG 的共有峰為研究對象，計算10 批TPP 及18 批的CFG 色譜圖中共有峰總峰面積的均值。以10 批TPP 共有峰總峰面積的均值為基準值1，計算各CFG 共有峰總峰面積的相對值[9，14]。結果，A、B、C 廠CFG 供試品共有峰總峰面積的相對值為0.89、0.69、0.75，表明CFG 中各成分的總量相對于TPP 有不同程度的降低。

2.5.4 TPP、CFG 指紋圖譜相關性比較 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”對TPP 及CFG 樣品色譜圖進行分析。以S1 為參照圖譜（采用中位數法、時間寬度為0.1 min），進行多點校正和峰匹配，評價28 批供試品。結果，與TPP 相比，A 廠、B 廠（0.957、0.926）相似度較高，C 廠（0.894）稍低（見圖4）。

圖4 相似度評價結果Fig 4 Similarity

2.5.5 化學成分含量比較 采用外標法計算TPP及CFG 中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊異黃酮及芒柄花素的含量，以10 批TPP 供試品各成分含量的均值為基準1，計算A、B、C 廠CFG 樣品中各成分含量的相對值及5 種成分總量的相對值[15-16]。結果，CFG 中各成分含量相對于TPP 均有不同程度降低，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮及芒柄花素含量順序為TPP ＞CFG-A ＞CFG-C ＞CFG-B，阿魏酸和芒柄花苷含量順序為TPP ＞CFG-B ＞CFG-C ＞CFG-A；5 種成分總含量順序為TPP ＞CFG-A ＞CFG-C ＞CFG-B，見圖5。

圖5 各供試品含量相對值Fig 5 Relative value of each sample

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本研究考察了不同色譜柱（Agilengt、YMC、Phenomenex、GL Sciences），不同流動相[乙腈-水、乙腈-（0.1%磷酸-水）、乙腈-（0.05%磷酸-水）]，不同柱溫（30、35 ℃），不同檢測波長（230、260、315 nm）等對色譜圖的影響，最終確定為本研究的色譜方法。

3.2 指紋圖譜比較的分析

指紋圖譜能全面反映中藥飲片或制劑的內在物質特征，其整體性及模糊性的特征，適合對中藥飲片及制劑內在質量的控制與研究[17]。本研究通過指紋圖譜法比較TPP 與不同廠家CFG 的差異，發現TPP 與CFG 相似度均在0.89 以上，說明雖然制備工藝不同，但是原料來源基本是一致的，所以相似度較高[10，14，18]。TPP 中峰14 的出現及CFG 峰22 的出現，表明了TPP 與CFG 相比有化學成分的生成與消失[13]。通過各供試品共有峰總峰面積的比較，發現不同廠家的CFG 相比TPP 均有不同程度的降低，提示了各廠家CFG 的標識量存在一定誤差，在臨床應用中應進行修正。

3.3 指標成分選定

本方由4 味中藥組成，根據中藥復方君臣佐使的組方原則，優先選擇君藥（黃芪）及臣藥（當歸）的化學成分作為TPP 與CFG 的差異性對比指標[19]。根據文獻報道，黃芪中化學成分復雜，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素及毛蕊異黃酮均為其主要活性成分及質量評價指標，具有提高免疫、調節血壓、保護血管和腎組織、抗衰老及抗氧化等作用，因黃芪甲苷為皂苷類成分，基本無紫外吸收，宜采用ELSD 檢測，因實驗室條件限制，未對黃芪甲苷進行檢測[20-22]；阿魏酸為當歸中重要的質量評價指標，具有抗血栓、抗炎、降血脂等藥理作用，發揮活血祛瘀功效[23]，當歸中藁本內酯等揮發性成分，受熱不穩定不宜作為對比指標。故本試驗選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊異黃酮及芒柄花素為指標成分研究TPP 與CFG 的差異性。

3.4 已知化學成分含量比較的分析

本研究通過對比TPP 與3 個廠家CFG 中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的含量測定結果，發現各廠家CFG 中5 種成分含量均有不同程度降低，B 廠家的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量及A 廠家的芒柄花苷明顯較低，表明CFG 的質量控制應當統一標準，以便達到相同的臨床應用效果。

綜上分析，TPP 與CFG 相比，化學成分的種類和數目隨飲片來源及生產工藝的變化而產生差異。TPP 無論從共有峰總面積還是指標成分含量均具有明顯優勢，提示了CFG 在臨床應用中應調整使用當量，以促進臨床應用。

本研究通過指紋圖譜和化學模式識別方法，從定性和定量兩個方面，對比了芪苓益腎顆粒傳統制備工藝與中藥配方顆粒的差異，課題組將從譜效關系和臨床療效繼續深入研究，闡明兩者差異規律。