人胎盤ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)格列本脲胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

黃樺，王晶晶，李騫，張峻（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)科，昆明 650032）

妊娠期用藥安全性受到社會(huì)高度關(guān)注，過(guò)去臨床上通常以美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）的“妊娠期用藥安全分級(jí)”為主要依據(jù)對(duì)孕期用藥安全及風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，因FDA 分級(jí)過(guò)于依賴動(dòng)物研究，且存在更新慢、分級(jí)簡(jiǎn)單、爭(zhēng)議大等問(wèn)題，越來(lái)越多的專家和學(xué)者建議完善妊娠期用藥安全性信息，F(xiàn)DA 也于2015年提出更新妊娠期用藥評(píng)價(jià)規(guī)則。但是，種屬差異和倫理原則的限制給妊娠期用藥安全性信息的獲取帶來(lái)困難。胎盤作為母體與胎兒之間的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換場(chǎng)所，是維持胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的重要器官和保護(hù)屏障。基于人胎盤建立的體外循環(huán)灌注模型是目前唯一一種用于研究物質(zhì)在完整人胎盤組織中轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停茄芯客鈦?lái)物質(zhì)（如藥物、毒物、環(huán)境污染物等）能否透過(guò)胎盤、對(duì)胎兒造成暴露的經(jīng)典模型，應(yīng)用該模型進(jìn)行藥物的體外胎盤透過(guò)性研究是評(píng)價(jià)妊娠期用藥安全性的重要依據(jù)[1-3]。

妊娠期糖尿病是妊娠期常見的并發(fā)癥之一。妊娠期糖尿病患者應(yīng)及時(shí)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)，當(dāng)飲食治療和運(yùn)動(dòng)不能有效控制血糖時(shí)，胰島素是治療的首選藥物。但由于給藥途徑和治療費(fèi)用等原因，孕產(chǎn)婦常無(wú)法堅(jiān)持胰島素治療。因此，口服降糖藥在妊娠期糖尿病治療中的合理使用備受關(guān)注。第二代口服磺酰脲類降糖藥格列本脲因使用方便，且經(jīng)濟(jì)有效，已被美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)納入妊娠期糖尿病可選擇的口服降糖藥之一[4]。但目前格列本脲在國(guó)內(nèi)妊娠期使用安全性數(shù)據(jù)有限，并未納入我國(guó)妊娠期治療糖尿病的注冊(cè)適應(yīng)證。為此，本課題組前期應(yīng)用人胎盤體外循環(huán)灌注模型開展了格列本脲的體外胎盤透過(guò)性研究，結(jié)果表明，格列本脲在中國(guó)人群中的胎盤透過(guò)率極低[5]，其原因除了較高的血漿蛋白結(jié)合率（99.8%）和較短的終末消除半衰期（約10 h）外，更重要的還歸因于胎盤合胞體滋養(yǎng)層中的ATP 結(jié)合盒（ABC）外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括P-糖蛋白（PGP）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）以及多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRPs）等，格列本脲已被證明是ABC 外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物[6-7]。PGP 可將藥物外排至細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)濃度，是胎盤屏障的重要組成部分，但是研究未證明PGP 參與了格列本脲的轉(zhuǎn)運(yùn)[6，8]。MRPs 主要分布在胞內(nèi)膜系統(tǒng)上，通過(guò)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)排出進(jìn)入細(xì)胞或胞內(nèi)產(chǎn)生的有害物質(zhì)。一項(xiàng)基于人胎盤體外灌注模型的研究表明，吲哚美辛的加入并未影響格列本脲的胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)[9]；但另有研究表明，MRPs 能夠優(yōu)先參與格列本脲的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。BCRP 廣泛分布于胎盤合體滋養(yǎng)層中，研究表明，BCRP 是格列本脲的主要外排轉(zhuǎn)運(yùn)體[7-8，10-11]。Hemauer 等[12]研究結(jié)果則表明，格列本脲被PGP、BCRP 和MRPs 轉(zhuǎn)運(yùn)的比例分別為（9±5）%、（25±5）%以及（43±4）%。由此可見，國(guó)外研究結(jié)果對(duì)于ABC 家族中參與格列本脲經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)的主要外排蛋白結(jié)論不一，且胎盤是最具種屬差異的器官，因此，在中國(guó)人群中開展相關(guān)研究尤為重要。

為進(jìn)一步明確格列本脲經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)的主要外排蛋白，本研究應(yīng)用人胎盤體外循環(huán)灌注模型，并結(jié)合特異性PGP 抑制劑維拉帕米、BCRP 抑制劑尼卡地平和MRPs 抑制劑吲哚美辛，進(jìn)行ABC外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)格列本脲經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)影響的研究，為格列本脲在妊娠期的合理使用提供參考。

1 材料

自然分娩或剖宮產(chǎn)剛娩出的健康、完整、足月（孕37 ～41 周）的人胎盤222 例（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科），研究方案經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫理批件號(hào)：（2016）倫理L 第5-1 號(hào)]。

磁力加熱攪拌器P-HPS75（美國(guó)Talboys 公司）；蠕動(dòng)泵（含Masterflex L/S 07523-90 泵控制臺(tái)和Masterflex L/S easy-load Ⅱ泵頭，美國(guó)Cole-Parmer 公司）；透明加熱循環(huán)浴槽Itherm-19M（德國(guó)Vivo 公司）；Simplicity 純水儀（美國(guó)Millipore公司）；血?dú)夥治鰞xSH138-iSTAT（美國(guó)雅培公司）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀UniCel DxI 800（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。

格列本脲對(duì)照品（美國(guó)Alfa Aesar 公司，批號(hào)：10099682，純度＞99%）；維拉帕米對(duì)照品（批號(hào)：100223-200102，純度＞99.9%）、尼卡地平對(duì)照品（批號(hào)：100586-201102，純度＞99.9%）、安替比林對(duì)照品（批號(hào)：100506-200301，純度＞99.9%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；吲哚美辛對(duì)照品（大連美侖公司，批號(hào)：J0426A，純度＞99.7%）；Krebs-Ringer Bicarbonate 緩沖液（邁晨科技有限公司，批號(hào)：D2712140）；牛血清白蛋白（美國(guó)Biosharp 公司，批號(hào)：MR30354）；碳酸氫鈉注射液（濟(jì)南利民制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：13120802，規(guī)格：0.5 g）；肝素鈉注射液（江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：1312108，規(guī)格：12500 單位）；乙腈（Merck 公司，色譜純）；甲醇（Merck 公司，色譜純）；甲酸（Adamas 公司，色譜純）；水為自制超純水。

2 方法

胎盤娩出運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，按照參考文獻(xiàn)方法[2，5]建立母體側(cè)和胎兒側(cè)的雙向閉合循環(huán)，并分為4 組，每組循環(huán)灌注10 例。各組的試驗(yàn)藥物及其在母體池中的濃度分別為：

格列本脲組：格列本脲（200 ng·mL－1）；PGP 抑制劑組：格列本脲（200 ng·mL－1）和維拉帕米（13.5 μg·mL－1）；BCRP 抑制劑組：格列本脲（200 ng·mL－1）和尼卡地平（40 μg·mL－1）；MRPs 抑制劑組：格列本脲（200 ng·mL－1）和吲哚美辛（280 μg·mL－1）。30 min 預(yù)灌注后，在母體池中加入適量安替比林（終質(zhì)量濃度為100 μg·mL－1）；并按照分組在母體池中加入試驗(yàn)藥物。

循環(huán)灌注3 h，于循環(huán)開始后0、10、20、30、45、60、90、120、150、180 min 采集母體側(cè)與子體側(cè)的樣本，按本實(shí)驗(yàn)室前期建立的UFLCMS/MS 法[13]測(cè)定胎盤灌流液中格列本脲濃度。每30 min 從母體池取樣，使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀UniCel DxI 800 測(cè)定人絨毛膜促性腺激素 （β-hCG）濃度；每30 min 分別從母體和子體灌流液取樣，使用血?dú)夥治鰞xSH138-iSTAT 檢測(cè)pH 值、pO2、葡萄糖和乳酸。

模型建立成功的評(píng)價(jià)指標(biāo)為[2-3，5]：① 陽(yáng)性標(biāo)記物安替比林的透過(guò)率＞20%；②3 h 循環(huán)灌注的子體側(cè)滲漏量≤12 mL；③ 母體側(cè)pO2維持在187 ～262 mmHg（1 mmHg ＝0.133 kPa），子體側(cè)pO2維持在75 ～112 mmHg；④ 母體池和子體池pH 值維持在7.2 ～7.45；⑤ 葡萄糖消耗量、乳酸生成量以及母體池β-hCG 無(wú)較大波動(dòng)。

格列本脲胎盤透過(guò)率按如下公式計(jì)算：FTR ＝Cf×100/Cm，其中Cf為循環(huán)結(jié)束時(shí)子體側(cè)藥物濃度，Cm為母體側(cè)初始藥物濃度。為降低不同胎盤小葉之間大小、絨毛層厚度、血管壁厚度等差異造成的誤差，同時(shí)計(jì)算其相對(duì)透過(guò)率，即格列本脲胎盤透過(guò)率與陽(yáng)性標(biāo)記物安替比林胎盤透過(guò)率的比值。

3 結(jié)果

本研究共建立222 例胎盤體外循環(huán)灌注模型，其中符合評(píng)價(jià)指標(biāo)的成功建模40 例。3 h 循環(huán)灌注過(guò)程中子體側(cè)平均滲漏量（6.20±4.35）mL（n＝40），乳酸生成量、葡萄糖消耗量及hCG分泌（見表1）保持穩(wěn)定，pH 和pO2均符合模型建立成功的評(píng)價(jià)指標(biāo)要求（見表2）。

表1 3 h 格列本脲胎盤透過(guò)性實(shí)驗(yàn)中葡萄糖消耗量、乳酸生成量及β-hCG 的平均變化量(n ＝36)Tab 1 Glucose consumption，lactate production and β-hCG secretion in 3 hours of glyburide (n ＝36)

表2 3 h 格列本脲胎盤透過(guò)性實(shí)驗(yàn)中pH、pO2 檢測(cè)結(jié)果(n ＝36)Tab 2 pH and pO2 of glyburide in 3 hours (n ＝36)

3 h 循環(huán)結(jié)束時(shí)，陽(yáng)性標(biāo)記物安替比林的胎盤透過(guò)率為（28.09±6.81）%（n＝40）。格列本脲組、PGP 抑制劑維拉帕米組、BCRP 抑制劑尼卡地平組以及MRPs 抑制劑吲哚美辛組格列本脲的胎盤透過(guò)率分別為（0.78±0.66）%、（2.17±0.90）%、（1.45±0.70）%、（3.65±2.10）%（n＝10）。不同ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑均不同程度地增加了格列本脲的胎盤透過(guò)率，見表3。

表3 不同ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑對(duì)格列本脲胎盤透過(guò)率的影響(x±s，n ＝10)Tab 3 Effect of different ABC transporters inhibitors on glyburide transplacental transfer (x±s，n ＝10)

4 討論

本研究成功建立40 例人胎盤體外循環(huán)灌注模型，研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)運(yùn)體PGP、BCRP 與MRPs均不同程度地參與了格列本脲的胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)，與未加入特異性蛋白抑制劑相比，MRPs 對(duì)格列本脲平均胎盤透過(guò)率的影響最大，PGP 次之，BCRP的影響最弱；根據(jù)相對(duì)胎盤透過(guò)率結(jié)果，MRPs和PGP 均對(duì)其有不同程度的影響，其中MRPs 影響較大，BCRP 基本無(wú)影響。推測(cè)在PGP、BCRP與MRPs 中，MPRs 可能是參與中國(guó)人群格列本脲胎盤外排的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體。

預(yù)測(cè)藥物的胎兒暴露情況對(duì)妊娠期用藥安全性評(píng)價(jià)至關(guān)重要，人胎盤體外循環(huán)灌注模型直接應(yīng)用人類胎盤組織進(jìn)行研究，能夠更真實(shí)直接地反映胎盤功能（包括物質(zhì)交換、代謝和分泌等功能）及藥物在胎盤中的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。但該模型通常納入健康足月胎盤建模，尚存在一定局限性。例如，對(duì)于妊娠期糖尿病患者，高血糖環(huán)境可能影響其胎盤的生理結(jié)構(gòu)和功能，一項(xiàng)針對(duì)廣東地區(qū)妊娠期糖尿病胎盤的研究表明，在基礎(chǔ)胰島素分泌降低并伴有胰島素分泌紊亂及胰島素功能抵抗的情況下，胎盤的組織結(jié)構(gòu)和功能可能會(huì)發(fā)生變化[14]。格列本脲在妊娠期糖尿病患者胎盤中的轉(zhuǎn)運(yùn)情況是否與正常健康胎盤一致，仍需后續(xù)進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

本研究應(yīng)用人胎盤體外循環(huán)灌注模型，為國(guó)內(nèi)首次進(jìn)行ABC 外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)格列本脲經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)影響的研究。結(jié)果表明，在PGP、BCRP 與MRPs 中，MPRs 可能是參與中國(guó)人群格列本脲胎盤外排的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體。本研究對(duì)完善格列本脲妊娠期用藥的安全性信息具有重要意義，同時(shí)為我國(guó)妊娠期糖尿病患者用藥選擇提供決策參考。