槲皮素通過調節AhR和Nrf2通路對HepG2細胞中藥物代謝酶GSTP1的影響

陳琪，劉婷婷，白圖雅，2，3，張夢迪，2，3*，胡玉霞，2，3，李君，2，3，常福厚，2，3*（.內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 000；2.內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心，呼和浩特 000；3.內蒙古自治區新藥篩選工程研究中心，呼和浩特 000）

藥物代謝酶在人體維持正常生理活動中發揮重要功能，比如攝入的藥物、食物等大部分物質是通過藥物代謝酶代謝后排出人體的，藥物代謝酶分為Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ相[1]。其中細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）屬于單氧酶的一類，在許多藥物代謝中起著關鍵作用，常見的Ⅰ相酶（CYP1A1、CYP1A2 和CYP1B1 等）將疏水化合物轉化為親水性發揮排毒過程；Ⅱ相酶，如谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione-S-transferases，GSTS），NAD（P）H：醌氧化還原酶-1 [NAD（P）H：quinone oxidoreductase-1，NQO1]，UDP-葡糖醛陽糖基轉移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGTS）和血紅素氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1），可以催化結合反應，使結合產物滅活，并增加代謝產物的水溶性以利于排泄；Ⅲ相酶系統由各種ATP 結合（ATP-binding cassette，ABC）轉運蛋白家族組成，參與排除藥物和異生物質及其代謝物[2]。代謝酶的不同活性狀態對抗腫瘤藥物有效性的影響非常重要，明確代謝酶在攝入藥物或者食物后的狀態是保證藥物活性的前提，本文欲探究天然植物中富含的槲皮素對谷胱甘肽-S-轉移酶P1（glutathione-S-transferase P1，GSTP1）的具體影響及機制。

芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一種配體依賴性轉錄因子，與芳烴核轉運蛋白（aryl hydrocarbon nuclear translocator，ARNT） 作為核伴侶蛋白形成異二聚體后，調節幾種藥物代謝酶的表達。這種 AhR/ARNT 復合物與二噁英或異生物質反應元件（dioxin or xenobiotic responsive element，DRE/XRE）的特定 DNA 序列結合，導致Ⅰ相酶和Ⅱ相酶的相鄰基因的轉錄激活，以及Ⅲ 期轉運蛋白，如多藥耐藥蛋白及相關蛋白的激活[3]。研究表明，AhR 還調節核轉錄E2 相關因子2（nuclear factor-erythroid-2-related factor 2，Nrf2）的表達[4]。細胞在受到氧化應激刺激后，Nrf2 逃離KELCH 樣ECH 關聯蛋白1（kelch-like ECHassociated protein 1，Keap1）介導的蛋白體降解并轉移至細胞核中。在細胞核中，Nrf2 與小Maf 蛋白形成異二聚體，復合物再與ARE 結合并誘導Nrf2 依賴性藥物代謝基因，包括 NQO1、UGT 和GST[5]。因此，AhR 通過Nrf2 途徑直接或間接調節藥物代謝酶的表達。

槲皮素（quercetin）為黃酮類化合物，具抗腫瘤、抗氧化、保護心血管等多種藥理作用[6]，抗肝癌活性尤為顯著，可以阻滯肝癌細胞周期，抑制肝癌細胞生長，具有顯著的抗腫瘤活性[7]。其抗腫瘤和化學預防特性可能是由于不同機制，包括自由基清除，改變信號轉導通路，誘導凋亡，抑制Ⅰ相酶對致癌物質的代謝和誘導Ⅱ相酶對致癌物質解毒。其中槲皮素在不同類型細胞中均可激活Nrf2-ARE 信號通路[8-9]。對GSTP1 表達的影響及對活性氧（reactive oxygen species，ROS）和電親物種的生物轉化特別有益。但具體的抗腫瘤機制目前尚未完全明確[10]，同時槲皮素以GSTP1為靶點發揮抗肝癌的作用機制也未闡明。本研究主要驗證槲皮素影響HepG2 細胞GSTP1 表達及分子機制，對今后槲皮素抗肝癌機制研究奠定理論基礎，為肝癌預防和診治方面提供新思路。

1 材料

1.1 細胞與試藥

人肝癌細胞株（HepG2）、抗體AhR（ab190797）、CYP1A1（ab235185）、Nrf2（ab62352）、NQO1（ab80588）、GSTP1（ab138491）、β-actin 抗體（英國Abcam），RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天），總RNA 提取試劑盒（TIANGEN），AhR 抑制劑（CH-223191）、Nrf2 抑制劑（ML-385）、槲皮素（B20527）（上海源葉有限公司），MTT、青霉素、鏈霉素、胰酶、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma 公司），Nuclear Extraction Kit（美國Thermo 公司），Rever Tra Ace q PCR RT Kit、SYBR Green 試劑盒（日本TOYOBO 公司），RNA simple Total RNA Kit（北京天根生化科技有限責任公司），DMEM 高糖培養基（美國Gibco 公司）。

1.2 儀器

倒置生物顯微鏡（BDS200，德國Leica 公司），垂直電泳儀（HE99X-15-1.5，美國Hoefer 公司），臺式高性能離心機（ST16R，德國Leica 公司），金屬浴（OSE-DB-01，北京天根生化科技有限責任公司），二氧化碳培養箱（Heraeus HERA cell 150i，美國 Thermo Fisher 公司），多模式微孔板檢測儀（Multiskan Mk3，Perkin Elimer 公司），－80℃超低溫冰箱、熒光實時定量PCR 儀（Thermo-Forma-702，美國Thermo Fisher 公司），超微量核酸蛋白測定儀（ND2000C，Nanodrop 公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

將人肝癌細胞系HepG2 置于含10%胎牛血清的DMEM 培養液中，在5% CO2、37℃恒溫培養箱中進行貼壁培養，待細胞增殖至對數期，用胰蛋白酶進行消化，傳代。

2.2 槲皮素對細胞活力影響

取HepG2 細胞接種96 孔板培養24 h 后，不同濃度槲皮素（20、40、80、160 μmol·L－1）繼續培養24 h，取出培養基后向細胞中加入含有0.5 mg·mL－1MTT 試劑，37℃孵育4 h，吸出MTT加入150 μL DMSO 震蕩搖勻10 min，570 nm 處測量吸光度，計算細胞增殖率。

2.3 核蛋白提取

取HepG2 細胞接種于6 孔板，采取不同濃度槲皮素（20、40、80、160 μmol·L－1）處理后，按照核蛋白提取試劑盒（ab78833）提取核蛋白。

2.4 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測mRNA表達

取HepG2 細胞接種于6 孔板，分為對照組，槲皮素組（40 μmol·L－1），Nrf2 抑制組（1 μmol·L－1），槲皮素＋Nrf2 抑制組，觀察槲皮素通過Nrf2 對GSTP1 的影響。另將細胞分為對照組，槲皮素組（40 μmol·L－1），AhR 抑制組（1 μmol·L－1），槲皮素＋AhR 抑制組，觀察槲皮素通過AhR 對GSTP1 的影響。收集各組細胞，按照TRIzol 說明書裂解細胞，使用氯仿提取總RNA，用紫外分光光度法測定RNA 樣品的OD260/OD280值，并進行定量。反轉錄引物見表1，擴增條件為：94℃ 5 min，92℃ 30 s，62 ℃ 30 s，74 ℃ 1 min，32 個循環。反應結束后，PCR 儀器自動生成標準曲線和擴增曲線，所得結果直接在熒光定量操作系統中進行比較分析，目標基因的相對定量用2－ΔΔCT計算。

表1 基因引物序列信息Tab 1 Gene primer sequence information

2.5 Western blot 檢測相關蛋白表達

收集藥物作用后細胞，離心和裂解收集后用BCA 方法測定蛋白濃度。取等量的蛋白質，SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白，濕轉法將蛋白條帶印跡到硝酸纖維素膜上，封閉緩沖液中培養，相應一抗在4℃的封閉緩沖液中孵育過夜，室溫下進行二次抗體培養1 h，采用增強化學發光法檢測蛋白質，采用Image J 軟件統計相對灰度值。

2.6 統計學方法

實驗數據采用SPSS 25.0 軟件分析，符合正態分布的計量資料采用x±s表示，組間比較進行單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 槲皮素對GSTP1 表達的影響

不同濃度槲皮素對HepG2 活力影響如圖1A 所示，當濃度達到80 μmol·L－1時對細胞增殖有抑制作用（P＜0.01）。不同濃度的槲皮素對GSTP1的表達影響如圖1B 所示，與對照組相比，不同濃度槲皮素組GSTP1mRNA 表達升高（P＜0.001），蛋白表達與基因水平結果一致，如圖1C、1D。根據上述結果選取槲皮素40 μmol·L－1的劑量作為后續研究分子機制的藥物濃度。

圖1 槲皮素對HepG2 活力及GSTP1 表達的影響Fig 1 Effect of quercetin on the vitality of HepG2 cells and the expression of GSTP1

3.2 槲皮素通過Nrf2 對GSTP1 的影響

槲皮素通過Nrf2 對GSTP1 的影響如圖2所示。與對照組相比，槲皮素組Nrf2、NQO1、GSTP1的mRNA 表達升高（P＜0.001），Nrf2 抑制劑組Nrf2、NQO1、GSTP1的mRNA 表達差異無統計學意義。Nrf2 屬于核轉錄因子，單獨添加抑制劑并不影響Nrf2 表達。與槲皮素組相比，槲皮素＋Nrf2 抑制劑組Nrf2、NQO1、GSTP1的mRNA 表達下降（P＜0.001）。蛋白表達與基因水平結果一致，說明槲皮素可以通過 Nrf2 激活GSTP1 的表達。

圖2 槲皮素通過Nrf2 對GSTP1 基因和蛋白表達的影響Fig 2 Effect of quercetin on the expression of GSTP1 gene and protein via Nrf2

3.3 槲皮素對Nrf2 核易位影響

如圖3 所示，隨著槲皮素濃度的升高，Nrf2從胞漿轉移到細胞核增多，說明槲皮素可以促進Nrf2 核轉錄活性，通過Nrf2 直接影響GSTP1 的表達。

圖3 不同濃度槲皮素對Nrf2 核易位的影響Fig 3 Effect of quercetin at different concentrations on Nrf2 nuclear translocation

3.4 槲皮素通過AhR 對GSTP1 的影響

槲皮素通過AhR 對GSTP1 的影響如圖4 所示。與對照組相比，槲皮素組的AhR、CYP1A1、GSTP1mRNA 表達升高（P＜0.01，P＜0.001），AhR 抑制劑組AhR、CYP1A1、GSTP1mRNA 表達差異無統計學意義。由于AhR 為芳香烴受體，屬于受體蛋白，單獨添加抑制劑不會影響AhR及下游CYP1A1、GSTP1 的表達。與槲皮素組相比，槲皮素＋AhR 抑制劑組AhR、CYP1A1、GSTP1mRNA 表達降低（P＜0.01，P＜0.001）。表明槲皮素可以通過激動AhR 信號通路進而影響GSTP1mRNA 的表達。AhR 與GSTP1 蛋白表達與基因水平一致。而CYP1A1 在蛋白水平差異無統計學意義，可能因為槲皮素作為AhR 低親和力配體低濃度時僅促進下游mRNA 轉錄水平，在翻譯過程可能受其他因素的干擾，導致CYP1A1 蛋白表達無明顯變化（見圖4）。

圖4 槲皮素通過AhR 對GSTP1 基因和蛋白表達的影響Fig 4 Effect of quercetin on the expression of GSTP1 gene and protein via AhR

4 結論

天然植物富含抗氧化和抗腫瘤的活性，大多與類黃酮的含量相關，此類物質可以調節藥物代謝酶活性[11]，故明確類黃酮對代謝酶的影響是研究黃酮類物質抗腫瘤機制必不可少的過程。本研究主要探討了槲皮素對GSTP1 代謝酶的調節作用，首先給予安全劑量范圍的槲皮素，GSTP1 以及AhR 下游CYP1A1 均有所上調（P＜0.01），阻斷AhR 后則下調（P＜0.01），證明了槲皮素可以通過AhR 信號通路影響GSTP1 的表達；同時還通過核轉錄實驗證明槲皮素可以通過Nrf2直接影響GSTP1 的表達，同樣Nrf2 相關信號通路標記物NQO1 在給予槲皮素刺激后表達上調（P＜0.01），給予Nrf2 阻斷劑后GSTP1 表達下降（P＜0.01）。這些結果均證明槲皮素可通過AhR 及Nrf2 信號通路激動GSTP1 的表達。

目前GSTs 被分為7 個亞型，分別為alpha（α）、pi（π）、mu（μ）、theta（θ）、omega（ω）、sigma（σ）和zeta[12]，這些同工酶參與了通過谷胱甘肽結合的外源性藥物的Ⅱ期解毒反應[13-14]，這在致癌物解毒和抗腫瘤藥物代謝過程中起到重要作用。它們可以通過結合活性化合物或藥物直接影響過度氧化或烷基化藥物的理化性質[15]。同時GST 酶在化療藥物的解毒中也發揮著重要作用[16]。有些藥物（如環磷酰胺）需要代謝酶轉化為強效烷化劑才能發揮細胞毒性作用，但同時需要代謝酶轉化為易排泄的復合物才可以消除毒副作用[17]。此外GST 的多態性與氟尿嘧啶和鉑為基礎的化療化合物藥效相關[18-19]，因此GST 家族成員在保證藥效及排泄解毒方面發揮重要的作用。

GSTP1 是GST 家族中研究最多的成員[20]。GSTP1基因位于染色體11q13 上，由9 個外顯子組成，長度為3.2 kb。GSTP1 具有廣泛的生理功能：參與代謝、解毒和消除潛在基因毒性異物復合物，代謝多種致癌化合物，保護細胞免受DNA 損傷和癌變。體現在細胞中的功能包括親電化合物的催化和脫氧、氧化應激調節、細胞信號傳導[21-22]。GSTP1 能有效地保護細胞免受致癌物和親電化合物的傷害[23-24]。在前列腺癌中普遍存在的GSTP1 的表觀遺傳沉默機制導致細胞長期氧化損傷后的存活率改變，表明GSTP1 具有保護和抗腫瘤功能[25]。GSTP1 還能縮短As2O3在細胞中的滯留時間。GSTP1 的分解代謝功能降低了細胞中As2O3的含量，從而阻斷As2O3誘導的細胞凋亡[26]。此外，GSTP1 還參與了煙草中致癌物的消除過程，且在正常細胞和癌細胞中都發揮著清除有毒物質的作用[27]。GSTP1 還參與保護細胞免受氧化劑誘導的DNA 損傷[28]，阻止脂多糖誘導的促炎因子過度產生，并具有抗炎作用[29]。總之，GSTP1 作為一種藥物代謝酶，在解毒、抗氧化及維持抗腫瘤藥物的活性中發揮著重要作用，機體需要保持一定含量及穩態的GSTP1 以維持機體的健康運轉。

本研究分析表明，槲皮素可以激動HepG2 細胞中GSTP1 的表達，其通過激動AhR 及Nrf2 信號通路進而改變GSTP1 的表達，這可以從AhR的下游CYP1A1 的表達被槲皮素激活所證實，Nrf2 的下游NQO1 同樣被槲皮素激動，雖然激活能力不一致，但對照已發表的研究表明，槲皮素產生的對抗氧化應激的保護趨勢一致[30-32]。總之，槲皮素可以激活HepG2 細胞中的AhR 和Nrf2信號通路，并且通過AhR 和Nrf2 信號通路調節GSTP1 的表達，這對理解槲皮素通過調節肝藥酶的活性進而發揮解毒抗氧化作用具有重要意義。