斜帶石斑魚BAG-1基因克隆及表達分析

李 星，吳子杰，溫依銘，劉結紅，蔡 佳*，簡紀常*

（1廣東海洋大學水產學院，廣東湛江 524088；2廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東湛江 524088；3廣東省水產經濟動物病害控制重點實驗室，廣東湛江 524088）

0 引言

【研究意義】斜帶石斑魚（）是我國南方沿海地區及東南亞各國的名貴海水養殖魚類之一，其經濟價值極高（王大鵬等，2012；張濤等，2018）。近年來，隨著斜帶石斑魚高密度、集約化養殖規模的不斷擴大，養殖環境日趨惡化，斜帶石斑魚養殖過程中細菌病和病毒病頻繁發生，且病原感染能誘導產生多種細胞死亡，其形式包括凋亡、自噬和壞死（Georgiadis et al.，2001；Qin et al.，2003，2006；陳大瑋等，2011）。BAG-1是篩選Bcl-2結合蛋白（Bcl-2-associated athanogene，BAG）時鑒定獲得的第一個蛋白，其C端含有BAG結構域，能介導BAG家族蛋白的抗凋亡活性（Doukhanina et al.，2006）。因此，研究基因在斜帶石斑魚各器官組織中的表達特征，有助于了解斜帶石斑魚在病原感染后的免疫防御機制，為其病害防治提供新的策略。【前人研究進展】BAG-1可能參與魚類應對病原入侵的免疫反應。細胞凋亡作為細胞程序性死亡的一種主要形式，已被證實在個體發育、損傷修復及病原清除等過程中扮演著重要角色（Yu et al.，2015），其過程主要受Bcl-2家族及相關蛋白的調控（Danial and Korsmeyer，2004）。BAG是一類抗凋亡蛋白家族，通過與Bcl-2相互作用而顯著增強Bcl-2的抗凋亡作用，促進細胞存活（Takayama et al.，1995）。BAG-1可通過與Raf-1絲氨酸/蘇氨酸激酶或Hsc70/Hsp70結合，促進細胞增殖（Pennell and Lamb，1997；Brive et al.，2001），且有研究證實外源刺激誘導的Hsp70表達可與Raf-1競爭性結合BAG-1，削弱Raf-1信號轉導，從而抑制細胞增殖（Song et al.，2001）；BAG-1還可作為Hsc70/Hsp70 的核苷酸交換因子（NEF）刺激Hsc70 ATP水解，調節細胞的應激反應、凋亡、增生和遷移（Knee et al.，2001；李穎等，2009），并參與蛋白酶體降解途徑與自噬間的切換，調節蛋白酶穩態（Minoia et al.，2014；Liu et al.，2020）。BAG-1的中心泛素樣結構域（UBL）與26S蛋白酶體（Knee et al.，2001）可直接相互作用，促進蛋白酶體降解靶蛋白，還能與具有E3泛素連接酶活性的CHIP（carboxy ter‐minus of Hsp70 interacting protein）及Hsp70形成三元復合物降解靶蛋白，同時BAG-1通過依賴于CHIP的泛素化參與蛋白酶體調控，在此過程中BAG-1的泛素樣結構域區可增強CHIP靶向蛋白的作用（魏瑞敏等，2016）。此外，人類巨細胞病毒（HCMV）感染胚胎肺細胞后，基因表達上調，而干擾基因表達能抑制HCMV的抗凋亡活性（Li et al.，2015），說明BAG-1在宿主抗病毒感染的免疫反應中發揮著重要作用；BAG-1在非小細胞肺癌組織中的陽性表達率明顯高于肺臟良性病變組織，對于細胞病變也有一定的抑制作用（馬家寶等，2009）。凋亡調控基因-1蛋白是基因的表達產物，與腫瘤的發生發展存在一定關聯（陳小波和鄭定容，2016）。Kermer等（2015）研究發現，過表達基因可顯著降低α突觸核蛋白突變體瞬時過表達對人類神經母瘤細胞產生的毒性效應。【本研究切入點】BAG-1作為抗細胞凋亡蛋白家族的成員之一，在細胞發育、增殖、分化及應激中發揮重要作用（Hückelhoven，2004；Watanabe and Lam，2006），但目前針對基因功能的研究主要集中在人類和高等脊椎動物，關于魚類細胞死亡調控因子在病毒感染中發揮作用的報道相對較少，對魚類基因的功能也知之甚少。【擬解決的關鍵問題】克隆斜帶石斑魚基因（）并對其結構特征、組織表達分布及在脂多糖（LPS）和聚肌胞苷酸（PolyI:C）刺激后的表達變化進行分析，進一步揭示魚類BAG-1在病原感染中的作用機制，也為了解魚類的抗病免疫提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試斜帶石斑魚購自湛江市東風水產市場，試驗前1周暫養于實驗室循環水系統中，活力良好，體表無傷。LPS和PolyI:C購自美國Sigma公司，Bio.analyzer 2100生物分析儀購自美國Agilent Technologies公司，PrimeSTAR HS DNA高保真聚合酶、Trans-Zol Up Plus RNA Kit、大腸桿菌DH5α感受態細胞及pMD18-T載體購自TaKaRa公司。

1.2 EcBAG-1基因克隆

1.2.1 引物設計與合成 通過對轉錄組數據篩選獲得基因EST序列，利用Primer Primer 5.0設計特異性引物（表1），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 根據TransZol Up Plus RNA Kit說明，分別提取斜帶石斑魚脾臟、肝臟、胸腺、頭腎、鰓、皮膚、肌肉、大腦、外周血淋巴細胞和心臟等10種組織的總RNA，使用1.0%凝膠電泳檢測其完整性，并以Bio.analyzer 2100生物分析儀檢測總RNA濃度。參照反轉錄試劑盒說明反轉錄合成cDNA模板。

1.2.3基因克隆及載體構建 根據斜帶石斑魚轉錄組數據，通過引物EcBAG-1-F/EcBAG1-R（表1）克隆基因，按PrimeSTAR HS DNA高保真聚合酶說明構建PCR反應體系50.0 μL：5×PrimeSTAR Buffer（MgPlus）10.0 μL，dNTP Mix‐ture 4.0 μL，上、下游引物（2.5 mmol/L）各2.5 μL，cDNA模板2.5 μL，PrimeSTAR HS DNA高保真聚合酶0.5 μL，ddHO 28.0 μL。擴增程序：98 ℃預變性5 min；98 ℃10 s，55 ℃5 s，72 ℃15 s，進行10個循環；98 ℃10 s，55 ℃5 s，72 ℃5 min，進行23個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物用1.0%瓊脂凝膠電泳進行檢測，目的條帶使用凝膠回收試劑盒純化回收，與pMD18-T載體連接后轉化DH5α感受態細胞，37 ℃下倒置恒溫振蕩培養過夜，菌液PCR檢測呈陽性的克隆送至廣州生工生物科技有限公司測序。

表1 EcBAG-1基因克隆及實時熒光定量PCR擴增引物序列信息Table 1 Information of primer sequence used in the cloning and real-time fluorescent PCR of EcBAG-1 gene

1.3 生物信息學分析

利用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找基因開放閱讀框（ORF）及其推導氨基酸序列；使用SMART（http://smart.embl-hei‐delberg.de/）獲取基因結構域；運用TMHMM Server v.2.0預測EcBAG-1蛋白跨膜結構域；通過SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/interactive）分別進行EcBAG-1蛋白二、三維結構預測；采用ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）預 測EcBAG-1 蛋 白 理論等電點（pI）、分子量及親水性參數等；在NCBI的Protein BLAST數據庫中搜索與EcBAG-1氨基酸序列相似性較高的BAG-1氨基酸序列，使用ClustalX和MEGA 5.0進行多序列比對，并通過MEGA 6.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹；運用PSORT Prediction（http://psort.hgc.jp/form.html）對EcBAG-1蛋白進行亞細胞定位預測分析。

1.4 LPS和PolyI:C刺激斜帶石斑魚

取暫養1周的健康斜帶石斑魚，采用腹腔注射法分別注射LPS（10 μg/mL）和PolyI:C（1 μg/mL），注射劑量0.1 mL/尾（Wei et al.，2017），對照組注射等量的PBS。注射0、6、12、24和48 h后分別從各處理組中隨機采集5尾斜帶石斑魚的脾臟，提取RAN后反轉錄合成cDNA（方法同1.2.2），液氮速凍后-80 ℃保存備用。

1.5 EcBAG-1基因表達分析

通過實時熒光定量PCR對健康斜帶石斑魚各組織中的基因進行檢測，以EcBAG-1-RT-F和EcBAG-1-RT-R為擴增引物，以為內參基因（表1）。實時熒光定量PCR反應體系10.0 μL：cDNA模板0.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×SYBR Green Mix（Roche）5.0 μL，雙蒸水3.5 μL。擴增程序：95 ℃預變性10 s；95 ℃5 s，58 ℃15 s，72 ℃20 s，進行33個循環。每個樣品設5個復孔，采用2法換算基因相對表達量（Livak and Schmittgen，2001），并以SPSS 20.0進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 EcBAG-1基因ORF序列分析結果

從斜帶石斑魚轉錄組數據中篩選獲得基因EST序列，設計引物進行PCR擴增，經測序比對后得到基因ORF序列長624 bp，共編碼207個氨基酸殘基（圖1）。EcBAG-1蛋白分子量為49.84 kD，pI為5.18，總平均疏水性為0.866，即EcBAG-1蛋白為疏水性蛋白。據SMART 4.0預測結果（圖2）顯示，EcBAG-1蛋白含有1個典型的家族結構域（BAG）和1個泛素結構域（UBQ）。TMHMM 2.0跨膜結構域預測結果表明，EcBAG-1蛋白不含跨膜結構域。通過PSITE對EcBAG-1蛋白進行功能位點預測，結果顯示該蛋白含有1個酰胺化位點、2個異戊二烯基結合位點、3個微體C端靶向信號、4個蛋白激酶C磷酸化位點、5個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、5個N-肉豆蔻酰化位點及1個真核硫醇蛋白酶組氨酸活性位點。EcBAG-1蛋白主要分布在細胞質和細胞核。

圖1 EcBAG-1基因ORF序列及其推導氨基酸序列Fig.1 ORF and amino acid sequence induction of EcBAG-1 gene

圖2 EcBAG-1蛋白結構域示意圖Fig.2 EcBAG-1 protein domain diagram

2.2 EcBAG-1蛋白二、三級結構預測結果

SOPMA預測結果顯示，EcBAG-1蛋白二級結構中α-螺旋（藍色）占65.22%、延伸鏈（紅色）占10.63%、無規則卷曲（紫色）占20.29%、β-轉角（綠色）僅占3.86%（圖3）。利用SWISS-MODEL對EcBAG-1蛋白三級結構進行預測，結果（圖4）發現該蛋白氨基酸序列與人類的BAG-1氨基酸序列具有較高的相似性，故推測EcBAG-1具有類似的生物學功能。

圖3 EcBAG-1蛋白二級結構預測結果Fig.3 Secondary structure prediction of EcBAG-1 protein

圖4 人類BAG-1蛋白（左）與EcBAG-1蛋白（右）三級結構的比較Fig.4 Tertiary structure comparison of BAG-1 protein in human（left）and EcBAG-1 protein（right）

2.3 EcBAG-1氨基酸序列比對分析結果

使用ClustalX對EcBAG-1氨基酸序列與大黃魚（）、斑馬擬麗魚（）、尼羅羅非魚（）、牙鲆（）、紅鰭東方鲀（）、紅鮭魚（）、斑馬魚（）、熱帶爪蛙（）、人類（）等物種的BAG-1氨基酸序列進行比對分析，結果（圖5）顯示，EcBAG-1氨基酸序列與大黃魚的BAG-1氨基酸序列相似性最高（96.62%），與熱帶爪蛙的相似性最低（57.50%）。結合SMART及NCBI發現，以上物種氨基酸序列均含有BAG保守結構域，即BAG-1蛋白在以上物種中具有高度保守性。

圖5 EcBAG-1氨基酸序列與其他物種BAG-1氨基酸序列的對比分析Fig.5 Comparative analysis of amino EcBAG-1 acid sequence with BAG-1 acid sequence in other species

2.4 系統發育進化樹分析結果

基于BAG-1氨基酸序列相似性，通過MEGA 6.0中的NJ法構建系統發育進化樹，結果（圖6）顯示，魚類全部聚為一支，哺乳類聚為一支，而原雞和熱帶爪蛙聚為一支。其中，斜帶石斑魚與大黃魚（XP_019113087.1）的分類地位最近，其BAG-1氨基酸序列相似性達96.62%；與斑馬擬麗魚（XP_004542998.1）、尼羅羅非魚（XP_003438109.1）、牙鲆（XP_0199666 54.1）、紅鰭東方鲀（XP_003975493.1）、紅鮭魚（XP_029504482.1）、斑馬魚（NP_001092206.1）的親緣關系較近，對應的BAG-1氨基酸序列相似性分別為89.86%、89.37%、89.86%、85.89%、82.61%和82.13%；與原雞（NP_001103162.1）和熱帶爪蛙（XP_0029395 43.2）的親緣關系相對較遠，對應的BAG-1氨基酸序列相似性分別為58.45%和57.50%。

圖6 基于BAG-1氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on BAG-1 amino acid sequences similarity

2.5 EcBAG-1基因組織表達分析結果

采用實時熒光定量PCR檢測健康斜帶石斑魚肝臟、胸腺、脾臟、頭腎、鰓、皮膚、肌肉、大腦、外周血淋巴細胞及心臟等組織中的基因表達情況，結果（圖7）表明，基因在以上組織中均有表達，且以在大腦中的相對表達量顯著高于在其他組織中的相對表達量（<0.05，下同）。

圖7 EcBAG-1基因在斜帶石斑魚不同組織中的表達情況Fig.7 Expression of EcBAG-1 gene of E.coioides in different tissues

2.6 EcBAG-1基因在病原感染后的組織表達特征

經LPS和PolyI:C感染刺激后，選取斜帶石斑魚脾臟組織進行進行基因表達檢測分析，結果（圖8）顯示，2種刺激對基因在斜帶石斑魚脾臟中的表達均具有時效性。經LPS刺激6、24和48 h后，基因相對表達量均呈上調趨勢，至刺激24 h時其相對表達量達最大值，但在刺激12 h時其相對表達量略有下調。經PolyI:C刺激6、12、24和48 h后，基因相對表達量均呈上調趨勢，同樣以刺激24 h時的上調幅度最大；與LPS刺激后的基因相對表達量相比，PolyI:C 刺激后基因相對表達量無明顯的下調趨勢。可以確定的是，在LPS和PolyI:C刺激24 h后斜帶石斑魚脾臟中的基因相對表達量顯著上調。

圖8 LPS和PolyI:C刺激后EcBAG-1基因在斜帶石斑魚脾臟中的表達情況Fig.8 Expression of EcBAG-1 in spleen of E.coioides after LPS and PolyI:C stimulation

3 討論

本研究從本課題組前期構建的斜帶石斑魚轉錄組數據（張海艷等，2018）中篩選獲得基因EST序列，利用Primer Primer 5.0設計特異性引物并成功擴增獲得基因。基因共編碼207個氨基酸殘基，其編碼蛋白含有BAG-1蛋白家族典型的BAG結構域和UBQ結構域，與已報道的BAG-1蛋白結構相同。通過BAG結構域，BAG-1能與絲氨酸/蘇氨酸激酶Raf-1或Hsc70/Hsp70競爭性結合，BAG-1與Raf-1的結合可激活Raf-1及其介導的信號通路，從而促進細胞生長；Hsp70與BAG-1的結合則削弱Raf-1活化和信號轉導，并抑制細胞生長（Doong et al.，2002）；UBQ結構域有利于BAG-1連接Hsc70/Hsp70與蛋白酶體，促進蛋白酶酶體降解多聚泛素化蛋白（Lüders et al.，2000），最終影響細胞的應激、生長及凋亡。PSORT Prediction預測結果顯示，EcBAG-1蛋白主要分布在細胞質，故推測該蛋白具有調控細胞死亡與胞內信號轉導的作用。氨基酸序列比對分析結果也顯示，EcBAG-1氨基酸序列與其他物種的BAG-1氨基酸序列高度相似，說明EcBAG-1蛋白可能具有相似的生物學功能。在基于BAG-1氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹中，斜帶石斑魚與其他魚類聚為一支，尤其與大黃魚的親緣關系最近。

在健康斜帶石斑魚體內，基因在檢測的各組織均有表達分布，其中在大腦中的相對表達量最高，顯著高于在其他組織中的相對表達量。哺乳動物基因功能研究顯示，基因表達與創傷性腦損傷相關（Hayashi et al.，2000；Xu et al.，2012），還能調控神經元前體細胞增殖（Elliott and Ginzburg，2009），暗示基因可能具有類似的功能。經LPS和PolyI:C刺激后，斜帶石斑魚脾臟中的基因表達顯著上調，表明該基因參與斜帶石斑魚抗病原感染的免疫反應。目前，有關的功能研究主要集中在人類和高等脊椎動物。由于BAG-1的表達水平與腫瘤分期及腫瘤細胞活性關聯，因此可作為胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的生物標志物（Sauerbrei and Haeussler，2018），還可增強增殖和存活的主要調控因子——核激素受體活性（Ozfiliz et al.，2015）；利用原核表達獲得的緩殖子特異性蛋白BAG-1建立間接ELISA，可實現對弓形蟲慢性感染豬進行鑒別診斷（熊冰清，2012）。然而，針對魚類基因的功能尚無研究報道。哺乳動物的基因研究發現，經LPS刺激后BAG-1與Hsp70的結合能介導核因子κB（NF-κB）p56亞單位的降解，從而抑制細菌感染引起的炎癥反應（Tanaka et al.，2014）；在人類巨細胞病毒感染后基因表達上調，進而抑制該病毒誘導的細胞凋亡（Li et al.，2015）；在衣原體的感染中基因也具有相似作用（Du et al.，2013）。基因過表達還能激活人類多瘤性病毒JC病毒（Human polyomavirus JC virus）早期基因啟動子的轉錄活性（Devireddy et al.，2000）。然而，近期有研究表明鋸緣青蟹基因沉默能抑制對蝦白斑病毒（White spot syndrome virus）的增殖及促進病毒感染誘導的細胞凋亡（Ma et al.，2019），說明基因可通過調控細胞死亡而參與宿主的抗病原感染免疫反應，因此推測基因也是通過類似的方式發揮作用，但具體原理有待進一步探究。

4 結論

EcBAG-1 蛋白含有BAG-1 蛋白家族典型的BAG結構域和UBQ結構域，具有與哺乳動物BAG-1相似的生物學功能，即基因在斜帶石斑魚抵御細菌/病毒感染的過程中發揮重要作用，為深入了解魚類的抗感染機理拓寬了思路。