外源過氧化氫處理對采后荔枝褐變及活性氧代謝的影響

潘家麗，覃子倚，李 靜，Khoo Hock Eng，董新紅

（桂林理工大學化學與生物工程學院/廣西電磁化學功能物質重點實驗室，廣西桂林 541004）

0 引言

【研究意義】荔枝（Sonn）是無患子科（Aspindaceae）荔枝屬（）植物，其味道鮮美，含有多種營養成分并具有多種生理功能，深受消費者喜愛（伍志權等，2017；齊文娥等，2019）。但荔枝是一種典型的非躍變型水果（Zhang et al.，2018），在采后貯藏階段易被病原菌侵染，且采后生理代謝活動依舊旺盛，使果實內部的水分和營養物質流失（李華彬等，2017），進而導致果實品質劣變，不利于荔枝的采后貯存和運輸。因此，積極開發實用、安全的采后保鮮技術，對荔枝果實貯藏品質、營養價值和商業價值的保持，以及貨架期延長均具有重要意義。【前人研究進展】目前大多采用涂膜、化學藥品處理、氣調貯藏和低溫貯藏等方法對采后荔枝進行保鮮處理（疏秀林等，2012；張長勇等，2013；Bhushan et al.，2015）。Lin等（2011）研究發現經1%殼聚糖涂膜處理能降低荔枝果實的呼吸作用，減少水分流失，延長貨架期。Liang等（2012）研究表明經60 g/L焦亞硫酸鈉浸泡能有效緩解采后荔枝的褐變反應，減少腐爛，從而延長果實的貯藏壽命。于茂蘭等（2014）研究表明在高氧氣調包裝下能延緩荔枝褐變相關酶活性，但不利于維生素C（Vc）含量的保持。周沫霖等（2016）研究發現低溫馴化結合低溫貯藏可使采后荔枝保持鮮紅色澤，維持較高的感官和口感品質。自由基衰老學說認為果蔬衰老的過程是活性氧（ROS）代謝與積累的過程（孫麗娜，2008；郭欣等，2020a）。從龍眼（Lin et al.，2014）、皇冠梨（王慶國等，2020）的研究中可知，過量的ROS累積會導致膜脂過氧化，破壞細胞膜結構，促進細胞衰老。因此，ROS水平是影響采后果實貯藏品質的重要因素。過氧化氫（HO）是一種強氧化劑，無色無毒，對環境友好，在食品行業中的應用越來越廣泛（石晶等，2009；Bauzá et al.，2014）。外源HO處理果實，對果實是一種氧化脅迫，這種氧化脅迫可能會提高果實對其他脅迫，如冷害、高溫、水分脅迫時的抗氧化防護能力（劉揚，2009）。趙習姮等（2010）研究發現HO處理可誘導提高櫻桃番茄和芒果的抗氧化酶活性，增加抗冷性，減輕冷藏期間受到的冷害問題；劉佩等（2017）研究表明采后黃冠梨經HO預處理，可抑制多酚氧化酶（PPO）活性和酚類物質消耗，從而減少果皮褐變的發生。【本研究切入點】雖然目前已有外源HO處理采后水果進行保鮮的研究，但尚未見關于外源HO對荔枝采后褐變及ROS代謝的研究。【擬解決的關鍵問題】通過研究不同濃度HO處理對荔枝各生理指標變化的影響，探討外源HO對荔枝采后褐變及ROS代謝的影響，為荔枝采后保鮮提供途徑，以期提高果實的貯藏品質。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

妃子笑荔枝購自桂林市五里店果蔬批發市場（當天采摘無處理），HO溶液（純度99%）購自上海源葉生物科技有限公司。主要儀器設備：FSJA03E1小熊粉碎機（小熊電器股份有限公司）、722PC可見光分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）、TU-1950紫外分光光度計（濟南思奇醫療設備有限公司）、PHS-3E電導率儀（上海儀電科學儀器股份有限公司）和NR60CP色差儀（深圳市三恩時科技有限公司）。

1.2 試驗方法

取大小相近、色澤均一、無病蟲害、成熟度相近的荔枝，于常溫下分別用1、5和10 mmol/L的HO溶液浸泡3 min，以清水處理為對照（CK），自然晾干荔枝表皮水分后，用保鮮袋分裝于4 ℃下貯藏，分別于貯藏后0、3、6、9和12 d取樣，進行失重率、褐變指數和細胞膜透性等生理指標測定；使用液氮速凍粉碎荔枝果皮樣品，用于丙二醛（MDA）含量、內源HO含量、超氧陰離子（O）產生速率、PPO活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性等指標的測定。所有試驗重復3次，結果取平均值。

1.3 測定指標及方法

失重率參照王磊明（2018）的方法測定；褐變指數參照蔣儂輝等（2019）的方法測定；MDA含量參照Liu等（2018）的方法測定；細胞膜透性參照李靜等（2016）的方法，將切取的果皮圓片于25 ℃浸泡3 h，采用電導率儀（PHS-3E）測定；內源HO含量和O產生速率參照曹建康等（2007）的方法測定，提取上清液的離心時間均為30 min；PPO活性參照白國榮（2019）的方法測定；SOD活性參照王照宇（2017）的方法測定，測定管置于4000 lx光照下反應20 min。

1.4 統計分析

采用Excel 2010進行數據處理，使用SPSS 25.0進行顯著性分析，以Origin 8.5繪圖。

2 結果與分析

2.1 外源H2O2處理對采后荔枝果實失重率的影響

由圖1可知，隨著貯藏時間的推移，采后荔枝果實失重率不斷升高。貯藏6 d后，5 mmol/L外源HO處理的荔枝果實失重率低于其他處理和CK，但差異不顯著（>0.05，下同），1 mmol/L外源HO處理的失重率與CK差異小，而10 mmol/L外源HO處理的荔枝果實失重率高于其他處理和CK，差異也不顯著。貯藏至第12 d時，5 mmol/L外源HO處理荔枝果實的失重率最低，較CK降低14.29%，10 mmol/L外源HO處理荔枝果實的失重率最高，較5 mmol/L處理增加26.56%，說明5 mmol/L外源HO處理能較好地降低采后荔枝果實的失重率，減少荔枝貯藏過程中水分與營養物質的損失，而10 mmol/L外源HO處理增加荔枝水分流失，加速果實品質下降。

2.2 外源H2O2處理對采后荔枝果皮褐變指數的影響

如圖2所示，在貯藏期間荔枝果皮的褐變指數不斷增大。貯藏3~9 d時，1和5 mmol/L外源HO處理能有效抑制果皮褐變，10 mmol/L外源HO處理的果皮褐變指數一直高于CK和其他處理。貯藏至第12 d時，1和5 mmol/L外源HO處理的荔枝果皮褐變指數較CK分別降低4.11%和24.66%，而10 mmol/L外源HO處理的果皮褐變指數最高，較5 mmol/L處理增加60.00%，加劇荔枝果皮的褐變。結果表明，低濃度的外源HO處理能抑制荔枝果皮褐變，其中5 mmol/L外源HO處理效果最佳，高濃度的外源HO處理則會加劇果皮褐變，加快荔枝衰老。

2.3 外源H2O2處理對采后荔枝果皮MDA含量的影響

由圖3可知，在0~12 d貯藏期間，CK與外源HO處理組的采后荔枝果皮MDA含量均表現出上升—下降—上升的變化趨勢。貯藏至第3 d時，1和5 mmol/L外源HO處理的荔枝果皮MDA含量顯著低于CK和10 mmol/L外源HO處理（<0.05，下同）；貯藏至第6 d時，各外源HO處理的果皮MDA含量均升高，其中5 mmol/L外源HO處理的MDA含量最低，且顯著低于其他處理和CK，較10 mmol/L處理降低35.08%；貯藏6~9 d時，果皮MDA含量下降，各處理和CK之間差異顯著；貯藏至第12 d時，5 mmol/L外源HO處理抑制MDA含量積累的效果最佳，較CK降低44.72%，而10 mmol/L外源HO處理的果皮MDA含量顯著高于CK和其他處理，其中較5 mmol/L處理增加88.73%。說明低濃度的外源HO處理能抑制荔枝果皮MDA 的產生和積累，高濃度（10 mmol/L）的外源HO則提高果皮中MDA含量。

2.4 外源H2O2處理對采后荔枝果皮細胞膜透性的影響

細胞膜透性可通過相對電導率高低來反映，相對電導率越高，細胞膜透性越大，反之亦然。如圖4所示，隨著貯藏時間的延長，不同處理采后荔枝果皮的相對電導率逐漸升高。1 mmol/L外源HO處理的相對電導率在貯藏3~6 d時顯著低于CK和10 mmol/L外源HO處理，貯藏9~12 d時則差異不顯著；5 mmol/L外源HO處理的相對電導率在貯藏3~12 d時顯著低于CK；而10 mmol/L外源HO處理的相對電導率在貯藏3~12 d期間始終保持最高，但與CK無顯著差異。進一步說明低濃度的外源HO處理能改善采后荔枝果皮細胞膜透性，其中5 mmol/L外源HO處理效果最佳，過高濃度則加劇細胞膜結構的破環程度。

2.5 外源H2O2處理對采后荔枝果皮內源H2O2含量的影響

由圖5可知，采后荔枝果皮在整個貯藏期間，CK與外源HO處理組之間的內源HO含量變化雖有所差別，但均呈上升趨勢。貯藏至第3 d時，各處理和CK的荔枝果皮內源HO含量差異不顯著；貯藏至第6 d時，10 mmol/L外源HO處理的果皮內源HO含量最高，顯著高于1和5 mmol/L外源HO處理；貯藏至第9 d時，10 mmol/L外源HO處理的果皮內源HO含量保持最高，1 mmol/L外源HO處理的果皮內源HO含量最低，且顯著低于10 mmol/L處理；貯藏至第12 d時，5 mmol/L外源HO處理的果皮內源HO含量顯著低于CK和其他處理，其中較CK降低13.75%，而10 mmol/L外源HO處理的果皮內源HO含量顯著高于CK和其他處理，較5 mmol/L處理提高31.36%。表明5 mmol/L外源HO處理能有效抑制采后荔枝果皮內源HO的產生，減少ROS積累，10 mmol/L外源HO處理則加速ROS累積。

2.6 外源H2O2處理對采后荔枝果皮O2-產生速率的影響

從圖6可看出，在貯藏期間，5 mmol/L外源HO處理的采后荔枝果皮O產生速率一直下降，且顯著低于CK和其他處理（貯藏3 d與CK無顯著差異除外），貯藏至第12 d時，5 mmol/L外源HO處理較CK降低22.63%；而其他處理在0~9 d貯藏期間，O產生速率均有一個先下降后上升的限降，在第9 d達最大值后又逐步下降，但貯藏末期（第12 d時）仍顯著高于5 mmol/L處理，CK、1 mmol/L和10 mmol/L外源HO處理的O產生速率較5 mmol/L處理分別增加29.24%、23.89%和29.65%。從O產生速率可看出，使用適宜濃度外源HO處理采后荔枝可抑制ROS產生，減少ROS應激導致的膜脂過氧化，延緩果實衰老進度。

2.7 外源H2O2處理對采后荔枝果皮PPO活性的影響

PPO是引起果蔬酶促褐變的主要酶類，可催化酚類物質氧化成醌類化合物，醌類化合物進一步聚合形成褐色或黑色的聚合物從而導致組織褐變。由圖7可知，貯藏期間采后荔枝果皮的PPO活性總體呈先上升后下降的變化趨勢，PPO活性峰值時間均出現在貯藏第3 d，說明PPO在荔枝貯藏前期較活躍。貯藏3~6 d，荔枝果皮PPO 活性開始下降，1 和5 mmol/L外源HO處理的果皮PPO活性明顯低于CK和10 mmol/L處理；貯藏6~9 d，荔枝果皮的PPO活性逐漸上升；9~12 d時，各處理和CK的果皮PPO活性均下降，貯藏至第12 d時，5 mmol/L處理的PPO活性顯著低于其他處理，較CK降低38.72%，而10 mmol/L HO處理的PPO活性顯著高于1和5 mmol/L處理，分別提高61.12%和136.97%，說明低濃度外源HO處理可抑制荔枝果皮的PPO活性，減少荔枝果皮的褐色物質生成，而高濃度外源HO處理加劇采后荔枝褐變速度，加速荔枝衰老。

2.8 外源H2O2處理對采后荔枝果皮SOD活性的影響

SOD是生物體內的一種抗氧化酶，可作為反映荔枝品質的重要指標之一。從圖8可看出，經外源HO處理的荔枝果皮SOD活性在貯藏前期（0~3 d）逐漸升高，且在第3 d時達峰值，5 mmol/L外源HO處理的荔枝果皮SOD活性最高，顯著高于其他處理和CK，較CK提高31.39%；貯藏3~6 d，各處理的SOD活性逐漸下降，貯藏至第6 d時，各處理和CK之間差異不顯著；貯藏6~9 d，各處理的SOD活性均下降，5 mmol/L外源HO處理的荔枝果皮SOD活性保持最高；在貯藏末期（第12 d），5 mmol/L處理的SOD活性較CK顯著提高31.41%，而其他處理之間差異不顯著，說明5 mmol/L外源HO處理可提高采后荔枝果皮的SOD活性，從而維持果實較高的抗氧化水平。

3 討論

果實采后品質下降與ROS氧化密切相關，當ROS處于正常水平時無害（Czarnocka and karpiński，2018）。但發生環境脅迫時，荔枝果皮O和HO的積累量就會增加，細胞膜透性增大，若過量的ROS無法及時消除，就會損壞生物大分子，促進細胞衰老，加速荔枝果實的腐敗。細胞內存在ROS清除體系，而SOD作為清除體系中重要保護酶之一，其對氧自由基具有抑制作用，可分解O和HO等活性氧化物，延緩植物衰老（張綠萍等，2012）。本研究結果表明，在4 ℃貯藏條件下3種濃度的外源HO處理均不同程度提高采后荔枝果皮的SOD活性，但經5 mmol/L外源HO處理的果皮SOD活性顯著提高，相比CK，在貯藏至第12 d時，SOD活性提高34.41%，與此同時內源HO含量減少13.75%，O產生速率減少22.63%，1 mmol/L處理的內源HO含量和O產生速率雖有減少，但效果不如5 mmol/L外源HO處理顯著，而10 mmol/L處理的內源HO顯著提高，說明5 mmol/L外源HO處理能有效增強荔枝果皮的自由基清除能力，抑制活性氧化物的產生。該研究結果與Liu等（2010）使用外源HO處理黃瓜、Li等（2011）使用外源HO處理小麥幼苗的研究結果相似，在適宜濃度外源HO的作用下，SOD活性與內源HO含量和O產生速率呈負相關，可提高植物的抗氧化水平，增強植物對其他脅迫的耐受力。

MDA是荔枝果實成熟軟化進程中膜脂過氧化的重要產物之一，可作為判斷荔枝果實是否進入衰老階段的指標之一。而細胞膜透性的大小反映出果皮細胞抗逆性的強弱，是評價果實品質的一個重要指標（郭欣等，2020b；千春錄等，2020）。本研究發現，在采后荔枝的貯藏期間，低濃度的外源HO處理可降低荔枝果皮的MDA含量和相對電導率，而經5 mmol/L外源HO處理的MDA含量和相對電導率降低效果最顯著，說明經5 mmol/L外源HO處理可減輕采后荔枝的膜脂過氧化作用，降低果皮電導率，改善細胞膜透性，減輕細胞膜的損害程度，與Chumyam等（2019）利用外源HO處理鮮切番石榴的研究結果一致。

PPO活性直接影響果皮褐變程度，果實組織中的酚類物質會經PPO的催化氧化形成醌類物，然后進一步聚合生成褐色物質，引起果皮褐變（馬巖松等，2000）。本研究結果表明，經1和5 mmol/L外源HO處理采后荔枝果皮的PPO活性和褐變指數均低于CK，而10 mmol/L處理均高于CK。貯藏至第12 d時，5 mmol/L處理的PPO活性較CK降低38.72%，褐變指數降低24.66%，有效減緩了荔枝果皮的褐變速率，保持荔枝良好的外觀和營養品質。該研究結果與Chen 等（2015）使用HO處理甜瓜、林毅雄等（2016）利用外源HO處理采后龍眼的研究結果相似，原因可能是適宜濃度的外源HO處理有效維持了三磷酸腺苷（ATP）含量，保持線粒體的完整性，抑制ROS代謝及膜脂過氧化的進行，從而延緩果皮褐變。果蔬品質的變化可通過失重率的變化反映出來，失重率上升越快說明果蔬品質越差。本研究發現，貯藏至第12 d時，CK和1、5、10 mmol/L外源HO處理的失重率較第9 d分別提高24.69%、21.52%、21.13%和32.39%，說明低濃度的外源HO處理能緩解荔枝失重率的上升速度，減少荔枝水分流失，高濃度的外源HO處理則加快失重率的上升，降低采后荔枝的品質。研究結果對于HO在果蔬保鮮貯藏領域的應用具有重要意義，生產中可通過將HO與其他成分如KMnO、CaO等復合配比處理果蔬，延緩果蔬貯藏品質的下降。后期還可對外源HO處理采后荔枝轉錄組進行測序分析，分析HO是如何對采后荔枝相關褐變及ROS代謝的基因進行表達，深入研究HO對采后荔枝貯藏品質的影響機理。

此外，本研究在測定失重率、MDA含量、相對電導率、O產生速率、PPO活性和SOD活性等指標時，由于不同原因導致的標準誤差較大。如失重率的測定中標準誤差過大可能是因為選取的采后荔枝雖大小相近，但荔枝存在個體差異性，隨著貯藏時間的延長水分流失速度不一樣而造成；相對電導率測定中部分數據標準誤差過大的原因可能是煮沸過程及補水過程的誤差；SOD活性測定部分數據標準誤差偏大的原因可能是受光不均勻影響了后續的吸光度測定等。但通過進一步統計，各處理相對標準差均低于20%，屬于合理誤差范圍內。

4 結論

本研究結果表明，采用5 mmol/L外源HO處理采后荔枝，最能減緩荔枝褐變程度和ROS累積，維持細胞膜的完整性，延緩果實品質下降。說明適宜濃度的外源HO處理可調節采后荔枝ROS代謝，過量的HO處理則會導致果實的衰老和褐變。