激光人工皺縮在單囊胚玻璃化凍融周期中的應用價值▲

張小慧 王世凱 毛獻寶 李政達 韋娉嬪 陳良師 薛林濤

(廣西壯族自治區人民醫院生殖醫學與遺傳中心，南寧市 530021)

近年來隨著人類輔助生殖技術成功率的提高，多胎妊娠導致的孕產期并發癥風險成為新的關注點，單胎足月活產已逐漸成為評價治療效果的關鍵指標，而單胚胎移植是獲得單胎足月活產的最有效途徑。囊胚移植由于具有胚胎發育與子宮內膜同步性更好、囊胚種植潛力更高等優點，是目前單胚胎移植周期中的首選治療方案[1]。同時，解凍囊胚移植不僅可以降低卵巢過度刺激綜合征的發生率，還可以改善子宮內膜薄的患者的臨床結局，以及減少新鮮囊胚移植導致的低出生體重和先天畸形的發生[2-5]。因此，解凍單囊胚移植已成為輔助生殖技術治療的一種重要手段。

減輕玻璃化凍融過程對囊胚發育的潛在損傷，是改善解凍單囊胚移植臨床結局的重要途徑。擴張的囊胚腔內存在大量液體，玻璃化凍融過程中存在冷凍保護劑不能充分與水分子置換的風險，容易形成冰晶，導致細胞損傷。而在囊胚冷凍前進行激光打孔以釋放囊胚腔內液體，可以有效地提高囊胚玻璃化凍融后的復蘇效率[6]，但是激光人工皺縮的臨床應用價值還有待進一步探討。因此，本研究基于單囊胚移植周期，分析激光人工皺縮對玻璃化凍融周期臨床妊娠結局的影響，探討其臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2013年1月至2019年1月在廣西壯族自治區人民醫院生殖醫學與遺傳中心接受單囊胚玻璃化凍融周期治療的296例患者(296個周期)的臨床資料。根據囊胚玻璃化冷凍前是否進行激光人工皺縮，將患者分為人工皺縮組和非人工皺縮組，分別為158例(158個周期)、138例(138個周期)。所有參與本研究的患者均充分知情同意并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 超促排卵方案與胚胎評估：根據患者基本情況選擇超促排卵方案，包括長方案、拮抗劑方案、微刺激方案、自然周期方案、黃體期超促排卵和孕激素期促排卵方案。當有兩個卵泡直徑≥18 mm時，肌內注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG；麗珠醫藥)10 000 IU,34～36 h后在陰道B超引導下穿刺取卵。根據精子情況行常規體外受精或卵胞漿內單精子顯微注射授精，觀察受精和胚胎培養情況。經患者知情同意后將受精后第3天剩余的胚胎行囊胚培養。受精后第5天及第6天觀察胚胎并進行質量評級[7]。囊胚移植或者冷凍保存的標準：囊胚腔分期為3期以上的內細胞團或滋養外胚層細胞評級至少有1個≥C級。在解凍復蘇周期，根據患者情況選擇自然、人工或促排卵周期方案行子宮內膜準備。

1.2.2 激光人工皺縮：采用OCTAX激光破膜儀(德國MTG公司)對人工皺縮組的擴張囊胚(Gander評分[7]為3期及3期以上為擴張囊胚)進行激光人工皺縮，在遠離內細胞團的滋養層稀疏處，使用3.5 ms的單次脈沖激光打孔，囊胚腔液迅速流出，囊胚腔皺縮，至囊胚腔完全收縮后，行囊胚玻璃化冷凍。非人工皺縮組囊胚不進行激光人工皺縮，直接玻璃化冷凍。

1.2.3 囊胚玻璃化冷凍及復蘇：使用囊胚冷凍/復蘇試劑盒(COOK公司)對囊胚進行玻璃化冷凍和復蘇。(1)玻璃化冷凍步驟。將囊胚放入V1液平衡5 min，轉移至V2液2 min，最后轉移至V3液，30～60 s內將囊胚裝載到標記好患者信息的高效安全封閉式載桿(Cryo Bio System公司)，迅速套外管加熱封口，放入液氮冷凍保存。(2)復蘇步驟。將裝載有囊胚的高效安全封閉式載桿迅速從液氮取出，放入W1液，囊胚脫落后轉移至新的W1液中平衡5 min，依次將囊胚在W2液和W3液中各平衡5 min。最后將囊胚轉移至預先平衡好的G-2TM培養皿(瑞典Vitrolife公司)中，置于37 ℃、6% CO2、5% O2培養箱中培養2～3 h，觀察囊胚是否復蘇成功。囊胚重新擴張到正常內細胞團和滋養外胚層形態，則視為存活并移植。復蘇成活囊胚數/解凍囊胚數為復蘇率。

1.2.4 觀察指標：復蘇囊胚移植14 d后，檢測血hCG，陽性為生化妊娠。復蘇囊胚移植35 d后B超檢查見到宮內孕囊為臨床妊娠，胚胎種植率=孕囊數/移植胚胎數×100%(單囊胚移植孕囊數僅計為1)。孕12周內妊娠丟失為早期流產，孕周≥28周分娩存活嬰兒為活產。

1.3 統計學分析 應用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數(百分比)表示， 組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組基本情況的比較 兩組女方年齡、子宮內膜厚度差異均無統計學意義(均P>0.05)，組間具有可比性；人工皺縮組囊胚復蘇率高于非人工皺縮組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組基本情況的比較

2.2 兩組妊娠結局的比較 人工皺縮組的臨床妊娠率、胚胎種植率和活產率均高于非人工皺縮組(均P<0.05)。兩組生化妊娠率、早期流產率和單卵雙胎率比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 兩組妊娠結局的比較[%(n/N)]

3 討 論

隨著輔助生殖技術的發展，妊娠率逐漸提高，同時多胎妊娠導致的妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、低出生體重和早產等并發癥越來越受到關注[8-9]。預防多胎妊娠的最佳方法是單胚胎移植，而單囊胚移植是較好的選擇[10]。囊胚體外培養可以篩選具有更好發育潛能的胚胎，囊胚移植時子宮內膜和胚胎發育的同步性更好，從而提高胚胎種植率，改善新生兒的臨床結局[11]。解凍囊胚移植周期的子宮內膜容受性及胚胎與內膜的發育同步性比新鮮囊胚移植周期更好，胚胎種植率和臨床妊娠率更高，早產率更低[12]。此外，解凍單囊胚移植周期的臨床妊娠率和活產率顯著高于單卵裂移植，且與雙胚胎移植無顯著差異，同時其可以顯著降低多胎妊娠率和早產率[13]。因此，解凍單囊胚移植在輔助生殖領域中得到廣泛認可。然而，擴張囊胚的腔液可能會影響囊胚的冷凍復蘇效果；玻璃化冷凍前進行激光人工皺縮可以釋放囊胚腔液，減少冷凍損傷，降低細胞毒性[6]。因此，本研究探討了激光人工皺縮在單囊胚玻璃化凍融中的臨床應用價值。

玻璃化冷凍是一種成功的囊胚保存方法，影響冷凍囊胚保存成功的重要因素之一是胚胎復蘇率。擴張囊胚腔中含有大量的液體，影響囊胚冷凍過程中的脫水速度，延長囊胚在玻璃化冷凍液中的暴露時間，從而增加冰晶形成的風險。玻璃化冷凍前對擴張囊胚行激光人工皺縮，釋放囊胚腔液，促進冷凍和解凍過程中保護劑的滲透，減少冰晶的形成，可降低冷凍保護劑的細胞毒性作用，減少滲透壓和冰晶對細胞的損傷，從而提高囊胚解凍后的擴張率，降低囊胚的凋亡率[14]。有研究顯示，與機械人工皺縮的囊胚相比，激光人工皺縮的囊胚復蘇后形態學評分更高，且移植后的臨床妊娠結局更好[15]。本研究采用激光對單囊胚行人工皺縮，玻璃化凍融后人工皺縮組的囊胚復蘇率為99.37%，高于非人工皺縮組的囊胚復蘇率(97.87%)。說明在單囊胚玻璃化冷凍前進行激光人工皺縮，減少囊胚腔液，可以減輕冷凍/解凍對囊胚的損傷，有利于囊胚復蘇。但兩組的囊胚復蘇率差異無統計學意義(P>0.05)，這可能與本研究樣本量小有關。

有文獻報告，激光人工皺縮能顯著提高解凍后的囊胚存活率和臨床妊娠率[16]。這是因為，囊胚腔液釋放后，不同大小的新鮮囊胚皺縮，呈均一的桑椹胚狀，解凍后它們充滿液體的速度明顯加快，重新擴張的平均時間縮短[17]。而解凍后囊胚再擴張的程度是活產率的最佳預測因子[10]。但是，目前激光人工皺縮對單囊胚解凍移植臨床結局的影響如何，相關研究較少。本研究結果顯示，人工皺縮組的臨床妊娠率、胚胎種植率和活產率均高于非人工皺縮組(均P<0.05)，但兩組的生化妊娠率、早期流產率和單卵雙胎率差異無統計學意義(均P>0.05)。這說明，在玻璃化冷凍前對單囊胚進行激光人工皺縮以釋放囊胚腔液，可以減輕胚胎凍融損傷，提高胚胎發育潛能，從而在不增加多胎妊娠率和早期流產率的基礎上，有效地提高單囊胚的種植率和活產率。

綜上所述，在囊胚玻璃化冷凍前進行激光人工皺縮，可提高臨床妊娠率和活產率，且不增加多胎妊娠率和早期流產率，在單囊胚玻璃化凍融周期中具有臨床推廣的價值。