沙利度胺治療β-地中海貧血外周血miR-223-3p水平變化及臨床價值

朱衛健，何 穎，黃慕芳，付社竹，王小琪，李志新，陳麗君，李小亮

(珠海市人民醫院 暨南大學附屬珠海醫院 血液風濕科, 廣東 珠海 519000)

β-地中海貧血(β-thalassemia)是一組先天遺傳性溶血性疾病，也是世界上最常見的單基因遺傳病之一，在我國南方及部分沿海地區發病率高。對于中間型及重型-地中海貧血臨床上缺乏有效的治療手段，這些患者需要定期輸血、祛鐵治療來維持生命，患者總生存時間短，生存質量及預后差。目前治愈方法包括，骨髓移植和基因或細胞治療，但治療費用昂貴，難以獲得匹配的骨髓，特別是基因治療，其安全性仍受到挑戰。

藥物誘導產生胎兒血紅蛋白(HbF)來替代或是逆轉α/β珠蛋白比例失調，能減輕β-地中海貧血的癥狀，被認為是治療重型β-地中海貧血的新策略，Chen等[1]的多中心、安慰劑、隨機對照臨床試驗顯示沙利度胺治療β-地中海貧血療效顯著，總有效率達69.4%，使患者脫離輸血或減少輸血，但其具體作用機制尚未闡明。

MicroRNAs(miRNAs)是一類長度為19～22個核苷酸的非編碼小分子RNA，參與轉錄后的基因調節，并在多種細胞發育過程中發揮作用，如細胞增殖、分化和凋亡[2-3]。越來越多的miRNAs被發現在β-地中海貧血的發病過程中起著重要作用，這些miRNAs可起到改善或加重β-地中海貧血的作用，miRNAs與靶mRNA的3'UTR區結合，并在轉錄后水平調節HbF的表達，從而影響β-珠蛋白合成減少或缺失引起的嚴重貧血。隨著miRNAs的更深入研究，科學家們開始探索miRNA在不同類型的血紅蛋白病調節中的作用，已有充分證據表明，miRNAs對紅細胞生成至關重要，在HbF表達調控中發揮關鍵作用[4]。有研究發現miR-26b、miR-151-3p、miR-29a-3p、miR-99b-5p通過抑制BCL11A，從而誘導γ-珠蛋白表達，用于治療地中海貧血及鐮狀細胞性貧血(SCA)等遺傳性血紅蛋白病[5-7]。而miR-15a和miR-16-1通過轉錄因子MYB3與HbF升高相關聯，miR-223-3p靶向LMO2的3'UTR下調γ-珠蛋白表達[8]，這些miRNAs可能是誘導HbF表達的靶分子。

我們從文獻報道與地中海貧血相關的候選miRNAs篩選出miR-223-3p，檢測miR-223-3p在沙利度胺治療β-地中海貧血患者在服藥前后的表達水平變化及分析miR-223-3p與血紅蛋白濃度及HbF的相關性，以期為藥物誘導γ-珠蛋白轉錄后機制探討提供新的依據。

1 資料與方法

1.1病例選擇 選取自2018年2月-2020年12月在我院參加臨床試驗的輸血依賴型β-地中海貧血患者8例，其中男性3例，女性5例，健康對照組選用同期在珠海市人民醫院的健康體檢者8例，無相關疾病，血常規正常。納入標準：①年齡≥14歲, 經基因檢查診斷符合中-重型β-地中海貧血；②ECOG體力評分0～3分，需定期輸血及祛鐵治療；③末次輸血距入組時間大于14天。排除標準：①合并感染性疾病、惡性腫瘤、肝腎功能不全等；②3個月內有動靜脈血栓形成病史者；③合并其他原因引起的貧血未糾正者；④精神病患；⑤不能口服藥物患者；⑥妊娠、哺乳期女性和不愿采取避孕措施的育齡受試者；⑦ 對本品過敏者、受試期間需要從事駕駛員及機器操作職業者。研究經珠海市人民醫院倫理委員會討論通過，所有患者或其監護人均簽署知情同意書。沙利度胺組口服沙利度胺100 mg/次，1次/d，于晚餐后頓服，可耐受者3天后加量到150 mg/d。

1.2試劑與儀器 淋巴細胞分離液、Trizol購自天津灝洋生物制品科技有限公司，逆轉錄PCR試劑盒、miRNAs引物、加尾法miRNA qtPCR試劑盒(廣州銳博生物公司)，酶標儀(Thermo Scientific, 美國)，Real-Time PCR 儀(Bio-Rad, 美國)、普通 PCR 擴增儀(Applied Biosystems, 美國)。

1.3外周血單個核細胞及總RNA的提取 早晨空腹，分別抽取輸血依賴型β-地中海貧血患者治療前和治療后及正常對照組靜脈血5 ml，EDTA抗凝，1 500 r/min離心10 min，去除血漿后的細胞，用淋巴細胞分離液密度梯度離心，分離外周血單個核細胞(PBMCs)所在的白膜層細胞，PBS洗滌2次，-80 ℃凍存備用。應用Trizol提取β-地中海貧血患者治療前和治療后及正常對照組PBMCs細胞中總的RNA。

1.4qRT-PCR檢測各組miR-223-3p表達水平 將各組總RNA采用逆轉錄法合成相應cDNA，采用 CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)程序檢測, miR-223-3p引物為：5’-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3’，計算基因表達水平時, 采用2-ΔΔCT法計算miR-223-3p的相對于標準品的基因表達水平。

2 結 果

2.1兩組臨床資料比較 8例β-地中海貧血中，有4例已行脾切除。β-地中海貧血患者的紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白(Hb)、紅細胞比容 (Hct)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)，均顯著降低(P<0.05)，血小板計數(PLT)及白細胞計數(WBC)均升高(P<0.05)，見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2β-地中海貧血患者外周血單個核細胞miR-223-3p表達水平 本研究發現β-地中海貧血患者外周血單個核細胞中miR-223-3p相對表達量為0.191±0.089，顯著高于對照組0.053±0.039(P=0.003)，口服沙利度胺后miR-223-3p相對表達量為0.106±0.047(P=0.047)，表達量下降，與β-地中海貧血患者服藥前相比差異有統計學意義。見圖1。

圖1 miR-223-3p在各組中的相對表達水平 注：*P<0.05

2.3miR-223-3p表達水平與臨床指標的相關性 β-地中海貧血患者外周血單個核細胞miR-223-3p表達水平與Hb水平(r=-0.488，P=0.015)，HCT(r=-0.420，P=0.004) 呈顯著負相關，見表2、圖2。

表2 miR223-3p相對表達水平與臨床指標的相關性

圖2 miR-223-3p相對表達水平與臨床指標的相關性

3 討 論

β-地中海貧血一種常染色體隱性遺傳的血紅蛋白疾病，是由于β珠蛋白基因突變或缺失引起的相應β肽鏈合成不足或缺如，相對過剩的α鏈沉積于紅系細胞內形成包涵體，導致無效紅細胞生成、慢性溶血、微血管阻塞等病理改變，β-地中海貧血中α/β鏈不平衡是其發病的病理生理基礎[9]，增加HbF是克服貧血和無效造血的重要治療手段。正常的人類個體在發育過程中，存在珠蛋白基因表達的轉換，出生后γ珠蛋白基因逐漸關閉，主要表達β基因。誘導γ-珠蛋白鏈表達可以平衡病理性α珠蛋白鏈增多，從而改善貧血和終止輸血依賴[10]。

在許多研究和綜述文獻中，對藥物在γ珠蛋白基因激活中的可能機制進行了闡述。科學研究已經確定的HbF分子調控因子，包括BCL11A、MYB、HBSIL、KLF1和miRNAs[11]。在這些調控通路中，miRNAs對HbF誘導的調控轉錄后通路起著重要作用。

Chen等[1]的多中心、隨機、雙盲的2期臨床試驗中顯示，接受沙利度胺治療的β-地中海貧血患者的 Hb 中位濃度升高達到了14.0(2.5～37.5) g/L ，而接受安慰劑治療的患者的Hb濃度沒有顯著變化。在12周內，接受沙利度胺和安慰劑治療的患者的平均紅細胞輸注量分別為(5.4±5.0) U 和(10.3±6.4) U(P<0.01)，在擴展階段，沙利度胺治療24周后Hb濃度持續增加，達到(104.9±19.0) g/L，無需輸血。表明沙利度胺為有效的HbF誘導劑，同時以往的研究揭示，沙利度胺誘導胎兒Hb的可能機制包括：①有效增強源于β珠蛋白基因突變的造血干細胞(HSCs)紅系祖細胞中GATA-1和EKLF的表達，誘導γ珠蛋白基因表達HbF[12]；②由于炎性細胞因子如由核因子κB(NF-κB)誘導抑制腫瘤壞死因子(TNF-α)，血管內皮生長因子(VEGF)和前列腺素E2(PGE2)合成與釋放的活性氧(ROS)的增加有關，ROS可以啟動P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，導致HbF水平升高[13]；③通過誘導信號轉導和轉錄激活子5(signal transducer and activator of transcription 5, STAT5)和促進紅細胞生成細胞凋亡的外部通路的抑制導致增加GATA-1轉錄因子的表達，而GATA-1能有效地誘導γ珠蛋白基因表達HbF[14]。

miRNAs通過轉錄后調控對HbF誘導方面的研究較少，本研究檢測服用沙利度胺后miR-223-3p表達水平的變化，推測其誘導HbF的可能機制。

生物信息學預測顯示，β-地中海貧血患者的外周血miRNA改變了2 833個基因。來自β-地中海貧血患者差異調控miRNA已經被預測其廣泛調控的功能，β-地中海貧血患者的血漿外泌體具有許多差異表達的miRNA譜，這些miRNA譜可能參與各種生物過程。Sun等[8]研究將LMO2的3' uts及其種子序列突變版本克隆到螢火蟲熒光素酶報告基因的開放閱讀框(ORF)下游，并評估miR-223下調熒光素酶表達的能力。發現miR-223-3p與LMO2野生型3'UTR結合，降低螢火蟲熒光素酶活性，此外，在K562細胞中，MiR-223-3p模擬物顯著下調了LMO2和γ-珠蛋白的表達，因此，判斷miR-223-3p通過LMO2靶向下調γ-珠蛋白表達。

我們應用實時定量PCR的方法，檢測文獻中報道過紅系調控有意義的miRNAs，篩選miR-223-3p這個候選miRNAs，并對輸血依賴型β-地中海貧血及口服沙利度胺有效的患者進行檢測，實驗結果顯示：miR-223-3p在輸血依賴型β-地中海貧血患者中高表達，口服沙利度胺后miR-223-3p 表達水平下降。

這些結果表明，miRNA是β-地中海貧血診斷和預后的潛在生物標志物，基于miRNA的治療策略可能被用作有效治療β-地中海貧血的方法。對紅細胞生成中miRNAs的研究闡明了其潛在的調控機制，并促進了相關診斷和治療的發展。然而，需要進一步的研究來驗證這一假設，特別是通過細胞、動物實驗來明確具體的調控通路。總的來說, 沙利度胺通過下調miR-223-3p 表達水平，可能使調控γ珠蛋白基因的重新激活，從而改善β-地中海貧血的病理生理和臨床癥狀，miR-223-3p有可能成為β-地中海貧血新的治療靶點。