復(fù)合益生菌協(xié)同復(fù)合酶發(fā)酵對(duì)玉米秸稈青貯品質(zhì)的影響

尹珺伊，劉秋瑾，王歡，金振華，孫金艷，史同瑞

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，秸稈資源豐富，可作為養(yǎng)殖動(dòng)物的粗飼料來(lái)源，但秸稈中粗纖維含量超過(guò)80%（李紅宇，2014），蛋白質(zhì)、礦物元素、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量較低，且質(zhì)地粗硬、適口性差，直接飼喂不易消化吸收，畜禽利用率低（Liu等，2019；Eastridge等，2017）。為了高效利用秸稈，必須對(duì)秸稈纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的細(xì)胞壁進(jìn)行降解，目前多通過(guò)添加纖維素酶和木聚糖酶的方法進(jìn)行酶解。應(yīng)用微生物發(fā)酵降解秸稈，在其生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中能夠分泌大量的酸類、酶類等活性物質(zhì)，起到軟化、酶解的作用（謝永生，2012）。同時(shí)，隨著有機(jī)酸的大量產(chǎn)生，秸稈環(huán)境的pH 降低，從而抑制其他有害細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)發(fā)酵秸稈的貯存時(shí)間。但單獨(dú)加入發(fā)酵菌或酶時(shí)降解效果不理想，主要體現(xiàn)在：一是菌劑從生產(chǎn)到發(fā)酵秸稈，所處環(huán)境發(fā)生改變，菌株易失活，穩(wěn)定性差；二是菌劑生產(chǎn)工藝還不完全成熟，造成活菌數(shù)低。而復(fù)合微生物菌劑可產(chǎn)生不同功能的酶，作用于秸稈纖維素、半纖維素、木質(zhì)素糖苷鍵不同鏈接位點(diǎn)，彌補(bǔ)菌種之間的差異（魯宇橦，2019）。

玉米秸稈作為中國(guó)三大作物秸稈，產(chǎn)量巨大。黑龍江是養(yǎng)殖大省，同時(shí)又是玉米種植大省，玉米秸稈資源豐富，將其轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)的粗纖維飼料，既符合中央關(guān)于糧改飼的發(fā)展方向，促進(jìn)秸稈資源的飼料化利用，減少環(huán)境污染，又可以帶動(dòng)動(dòng)物健康、高效、安全養(yǎng)殖發(fā)展。目前已有關(guān)于菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米秸稈的研究報(bào)道，發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)等含量?jī)?yōu)于單獨(dú)使用酶制劑或未經(jīng)發(fā)酵的秸稈（吳立坡等，2020；劉輝等，2016）。本試驗(yàn)擬利用菌酶協(xié)同發(fā)酵全株玉米秸稈，通過(guò)獨(dú)特的益生菌群和生物酶的降解作用，結(jié)合生物拮抗作用，旨在高效降解秸稈纖維的同時(shí)，殺滅秸稈飼料成品中的病原真菌和細(xì)菌，提高秸稈飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)，為高效利用玉米秸稈提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 供試菌株解淀粉芽孢桿菌SSY1、解淀粉芽孢桿菌SSY2、干酪乳桿菌RS1，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院微生物研究室分離鑒定并保藏；玉米秸稈由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院種植基地提供。

1.1.2 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；纖維素酶、木聚糖酶為飼料添加劑，纖維素酶活≥1000 U/g、木聚糖酶活≥1500 U/g，購(gòu)自滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；對(duì)照菌劑，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌含量≥1.0×1010cfu/g，購(gòu)自河北昕大洋內(nèi)丘生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、四硼酸鈉、無(wú)水磷酸氫二鈉、乙二醇二醚、正辛醇、硫酸、十六烷三甲基溴化胺、石油醚、硼酸、氫氧化鈉、硫酸銨、甲基紅、溴甲酚綠、硫酸銅、硫酸鉀、乙醇等均為分析純，購(gòu)自天津永大化學(xué)試劑研究開(kāi)發(fā)中心；高溫α-淀粉酶（商品編號(hào)：A8751-500 g），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；黃曲霉毒素總殘檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：ml036119）、嘔吐毒素檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：ml036117）和玉米赤霉烯酮檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：ml036116），購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安，型號(hào)：LDZX—75KBS）；潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾，型號(hào)：CJ—2NDI）；振蕩培養(yǎng)箱（北京東聯(lián)哈爾，型號(hào)：HZQ—F100）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特，型號(hào)：DH4000Ⅱ）；酸度計(jì)（德國(guó)賽多利斯，型號(hào)：PB—10）；高效液相色譜儀（日本島津，型號(hào)：SPD—20A）；電熱恒溫干燥箱（天津泰斯特，型號(hào)：202—2AB）；消化爐（上海晟聲，型號(hào)：GR20）；電阻爐（天津泰斯特，型號(hào)：SXJK—8—13D）；自動(dòng)纖維測(cè)定儀（上海晟聲，型號(hào)：F10）；全自動(dòng)定氮儀（上海晟聲，型號(hào)：K1306）；酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜，型號(hào)：RT—6000）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 全株玉米秸稈青貯的制備 干酪乳桿菌RS1 菌液、解淀粉芽孢桿菌SSY1 菌液、解淀粉芽孢桿菌SSY2 菌液、纖維素酶粉、木聚糖酶粉按質(zhì)量比50：10：10：1：1 進(jìn)行復(fù)配，制備秸稈復(fù)合生物發(fā)酵劑，活菌總數(shù)≥5×108cfu/mL、纖維素酶活≥1000 U/g、木聚糖酶活≥1500 U/g。設(shè)添加復(fù)合生物發(fā)酵劑、添加對(duì)照菌劑、自然發(fā)酵3 個(gè)試驗(yàn)組，每組3 個(gè)重復(fù)。選用無(wú)破損、厚度為0.8～1 mm的透明聚乙烯雙幅塑料筒膜制作青貯發(fā)酵袋，將塑料膜剪成長(zhǎng)約3 m，一端用塑料繩扎緊后翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)。選擇有較多綠色葉片保留的蠟熟期全株玉米秸稈，粉碎至2～4 cm，作為底料，將粉碎好的玉米秸稈堆積于發(fā)酵袋，邊堆積邊均勻噴灑發(fā)酵劑或清水并壓實(shí)，袋內(nèi)邊角不要留有空隙，發(fā)酵劑接種量為底料的1%，總含水量控制在65%～70%，以用手攥緊后指縫有液體滲出而不滴下為宜。最后扎口密封，袋內(nèi)不要留有空氣，上面用石塊或木板壓住（徐英民，2014）。發(fā)酵溫度約為20 ℃，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)20 d。

1.3.2 生物發(fā)酵玉米秸稈青貯品質(zhì)評(píng)定 發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)各組青貯成品相關(guān)指標(biāo)，依據(jù)《青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》（農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)司，1996）評(píng)定飼料成品質(zhì)量。

通過(guò)色澤、氣味、質(zhì)地進(jìn)行感官評(píng)定。稱取50 g 青貯成品放入1 L 三角瓶中，加450 mL 蒸餾水后封口，放入4 ℃冰箱中浸提24 h，用滌綸布過(guò)濾，并擠盡殘?jiān)械奶崛∫海枚繛V紙過(guò)濾，所得提取液保存?zhèn)溆茫ü５龋?021）。用酸度計(jì)測(cè)定pH。在提取液中加入25%的偏磷酸（浸提液與偏磷酸的體積比為5：1），靜置30 min，再1500 r/min、4 ℃離心15 min，上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，用高效液相色譜儀測(cè)定乳酸含量（柳俊超等，2015）。分別稱取各試驗(yàn)組樣本200 g，在烘箱中65 ℃烘干至恒重，粉碎后過(guò)40 目篩，密封保存?zhèn)溆茫ü５龋?021）。中性洗滌纖維（NDF）含量測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20806—2006《飼料中中性洗滌纖維（NDF）的測(cè)定》；酸性洗滌纖維（ADF）含量測(cè)定參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1459—2007 《飼料中酸性洗滌纖維的測(cè)定》；粗蛋白質(zhì)（CP）含量測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6432—2018 《飼料中粗蛋白的測(cè)定 凱氏定氮法》。

1.3.3 霉菌及毒素檢測(cè) 應(yīng)用ELISA 試劑盒檢測(cè)不同試驗(yàn)組青貯成品不同部位黃曲霉毒素、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮的含量，使用PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布，檢測(cè)霉菌含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 的One-Way Avova 進(jìn)行單因素方差分析和LSD 多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物發(fā)酵玉米秸稈青貯品質(zhì)評(píng)定 由表1可知，復(fù)合生物發(fā)酵劑組青貯pH 為3.6，水分71%，顏色為亮黃色，有酸香味，質(zhì)地松散柔軟不黏手，青貯感官得分為90，等級(jí)為優(yōu)；對(duì)照菌劑組青貯pH 為4.0，水分71%，顏色為褐黃色，有淡酸香味，質(zhì)地松散柔軟不黏手，青貯感官得分為74，等級(jí)為良；自然發(fā)酵組青貯pH 為4.2，水分70%，顏色為褐黃色，有淡酸味，質(zhì)地松散柔軟不黏手，青貯感官得分為64，等級(jí)為良。

表1 青貯飼料感官評(píng)定

2.2 生物發(fā)酵玉米秸稈青貯營(yíng)養(yǎng)水平 由表2可知，應(yīng)用復(fù)合生物發(fā)酵劑的青貯飼料NDF 含量與對(duì)照菌劑組、自然發(fā)酵組差異不顯著，但低于對(duì)照菌劑組和自然發(fā)酵組；ADF、CP、乳酸含量各組間差異顯著，應(yīng)用復(fù)合生物發(fā)酵劑的青貯飼料ADF 含量顯著低于對(duì)照菌劑組和自然發(fā)酵組（P ＜0.05），ADF 含量較自然發(fā)酵組減少31.61%，CP 和乳酸含量顯著高于對(duì)照菌劑組和自然發(fā)酵組（P ＜0.05），CP含量較自然發(fā)酵組增加10.29%，乳酸含量較自然發(fā)酵組增加10.25%。

表2 青貯飼料營(yíng)養(yǎng)水平 %

2.3 霉菌及霉菌毒素檢測(cè) 霉菌毒素是霉菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，具有高毒性和強(qiáng)致癌性，嚴(yán)重威脅人類健康和畜禽生產(chǎn)性能，本試驗(yàn)檢測(cè)了不同試驗(yàn)組青貯成品中霉菌及黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮的含量。結(jié)果見(jiàn)表3，復(fù)合生物發(fā)酵劑可有效抑制霉菌滋生，降低飼料中霉菌毒素含量，提高青貯飼料品質(zhì)。

表3 霉菌及其毒素檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 使用復(fù)合生物發(fā)酵劑對(duì)玉米秸稈青貯感官品質(zhì)的影響 優(yōu)質(zhì)玉米秸稈青貯的顏色應(yīng)為亮黃色，質(zhì)地松散軟弱不黏手，有甘酸香味的舒適感（農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)司，1996）。本試驗(yàn)結(jié)果中，未添加復(fù)合生物發(fā)酵劑和添加對(duì)照菌劑的玉米秸稈青貯后，顏色為褐黃色，氣味偏酸，說(shuō)明青貯品質(zhì)不好。而添加復(fù)合生物發(fā)酵劑制備的青貯質(zhì)地松散不黏手，顏色亮黃，氣味酸香，說(shuō)明添加復(fù)合生物發(fā)酵劑可以改善玉米秸稈青貯的感官品質(zhì)。

3.2 使用復(fù)合生物發(fā)酵劑對(duì)玉米秸稈青貯營(yíng)養(yǎng)水平的影響 NDF 和ADF 是反映動(dòng)物消化率的重要指標(biāo)，ADF 含量越低，飼草的消化率越高，飼用價(jià)值越大（周娟娟等，2016；Broderick等，2008；李向林等，2008）。本試驗(yàn)中，通過(guò)所添加益生菌和活性酶的生物降解作用，NDF 和ADF含量較自然發(fā)酵組分別降但4.30%和31.61%，CP 含量較自然發(fā)酵組增加10.29%，乳酸含量較自然發(fā)酵組增加10.25%。表明使用復(fù)合生物發(fā)酵劑有助于玉米秸稈的進(jìn)一步利用。這與曾佳佳（2021）、岳麗（2021）等在秸稈中添加復(fù)合微生物和木聚糖酶、纖維素酶，降低中性洗滌纖維含量，提高粗蛋白質(zhì)含量的結(jié)果一致。秸稈中的碳水化合物（WSC）可在青貯過(guò)程中為微生物尤其是乳酸菌的繁殖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，適宜的WSC和水含量可確保乳酸菌快速、大量地形成乳酸，促使pH 迅速下降（周瑞等，2019）。pH 快速降低能夠抑制不利于青貯的厭氧微生物如腸細(xì)菌和梭菌的生長(zhǎng)，減少蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分的損失，有利于調(diào)制優(yōu)良青貯（徐生陽(yáng)等，2019；任海偉等，2016；Cavallarin等，2011）。

3.3 使用復(fù)合生物發(fā)酵劑對(duì)玉米秸稈青貯霉變及霉菌毒素的影響 Cavallarin（2011）研究發(fā)現(xiàn)，大型養(yǎng)殖場(chǎng)青貯窖開(kāi)封15 d后，霉菌即在表層開(kāi)始生長(zhǎng)并有黃曲霉毒素產(chǎn)生。可見(jiàn)，青貯發(fā)霉變質(zhì)常以霉菌的出現(xiàn)為開(kāi)始。霉菌毒素是霉菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，具有高毒性和強(qiáng)致癌性，嚴(yán)重威脅人類健康和畜禽生產(chǎn)性能。本試驗(yàn)檢測(cè)了不同試驗(yàn)組不同部位青貯成品中霉菌及黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮的含量。自然發(fā)酵組和添加對(duì)照菌劑組在表層都檢測(cè)到霉菌，相同部位處霉菌毒素含量均高于添加復(fù)合生物發(fā)酵劑組。乳酸和代謝產(chǎn)生的乙酸，能有效防止霉菌和酵母菌等好氧性有害微生物對(duì)青貯秸稈的有氧腐敗（郭曉軍等，2017）。本試驗(yàn)中，添加復(fù)合生物發(fā)酵劑的青貯中乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌群，乳酸含量豐富，可減少成品中有害微生物的生長(zhǎng)，避免青貯成品二次發(fā)酵，提高青貯飼料品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性，與萬(wàn)學(xué)瑞（2020）的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)中，添加含解淀粉芽孢桿菌、干酪乳桿菌和木聚糖酶、纖維素酶的復(fù)合生物發(fā)酵劑可降低玉米秸稈青貯pH，降低NDF 和ADF 含量，顯著提高CP 和乳酸含量，改善青貯成品的感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，還可抑制和殺滅多種病原細(xì)菌和霉菌，避免青貯成品二次發(fā)酵，提高青貯有氧穩(wěn)定性，延長(zhǎng)保質(zhì)期。