外周血淋巴細胞亞群、Treg及細胞因子譜在不同病因血小板減少患者中的差異及意義

李雪梅 鄒東梅 孫雪靜 李霞 趙義 孫婉玲★

特發性免疫性血小板減少癥（Idiopathic im?mune thrombocytopenia，ITP）是臨床中原發性免疫性血小板減少癥的代表，結締組織病（Connective tis?sue disease，CTD）繼發血小板減少（CTD?TP）是最常見的繼發性免疫性血小板減少，是繼發性免疫性血小板減少癥的代表。研究顯示調節性T 細胞（regula?tory T cells，Treg）在維持人體的免疫耐受中發揮重要作用［1］，Treg 減少也參與多種結締組織病的發?。?］。同樣，在ITP 發病機制中，細胞免疫異常也具有更重要的作用［3］。Sylvain 等［4］發現ITP 患者體內自身反應性T 細胞增殖，刺激自身反應性B 細胞的增殖和分化，從而產生抗血小板自身抗體，導致血小板減少。為了探索免疫性血小板減少患者中免疫細胞及細胞因子水平的變化規律，本研究同時納入非免疫機制介導的血液系統疾病合并血小板減少（Hematological disease related thrombocytopenia，HD?TP）患者為研究組，比較各組外周血Treg、淋巴細胞亞群、血漿細胞因子譜水平的差異，從而進一步了解免疫性血小板減少的發病機制?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年1月至2022年2月首都醫科大學宣武醫院收治的不同病因導致的血小板減少患者61 例作為病例組，按照血小板減少的不同病因分為CTD?TP 組21 例，男5 例、女16 例，年齡（55.1±19.7）歲；ITP 組20 例，男6 例、女14 例，年 齡（52.55±20.3）歲；包括系統性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）12 例，原發性干燥綜合（Primary sjogren's syndromejavascript：PSS）9 例；ITP 組20 例，有抗核抗體（Antinuclear antibodies，ANA）陽性6 例。HD?TP 組20 例，男8 例、女12例，年齡（58.1±18.5）歲。全部為急性髓系白血?。ˋcute myeloid leukemia，AML）患者。收集患者的一般資料，包括年齡、性別、病程，外周血Treg，淋巴細胞亞群，血漿細胞因子，血小板計數等指標。另選擇同期健康體檢者30 名作為正常對照組，男3 例、女27 例，年齡（48.17±15.0）歲。四組間性別、年齡、病程、嚴重出血情況及合并用藥比較差異無統計學意義（P>0.05）。所有研究對象或家屬對本研究知情并簽署知情同意書。

納入標準包括：①符合結締組織病診斷標準［5?6］；符合ITP 診斷標準［7］；符合血液系統腫瘤診斷標準［8］；②年齡大于18 歲；③病例組入組需滿足血小板小于100×109/L，健康對照組需滿足血小板大于100×109/L（兩次不同日、間隔一周檢測結果）；④患者資料完整。排除標準包括：①合并惡性腫瘤（除外符合血液病入組病例）；②嚴重感染，肝脾腫大，嚴重肝腎功能不全，其他繼發性血小板減少，哺乳期、妊娠期女性。本研究已通過本院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集

患者空腹12 h，采血前1 天禁忌暴飲暴食和劇烈運動，在患者平靜狀態下用EDTA 抗凝管抽取靜脈血4 mL。

1.2.2 指標檢測

1.2.2.1 外周血淋巴細胞亞群檢測 絕對計數管中加入50 μL EDTA 抗凝外周血和混合抗體20 μL，包括BD 公司CD3?FITC、CD45?PerCP?Cy5.5、CD4?PE?Cy7、CD56?PE、CD16?PE、CD19?APC、CD8?APC?Cy，充分震蕩混勻，常溫避光孵育20 分鐘，加入450 μL 紅細胞裂解液，離心、洗滌后上機常規檢測淋巴細胞亞群絕對計數。流式細胞儀為BD FACS AriaⅡ。CD3+細胞為總T 細胞，其中CD4+T 細胞為輔助T 細胞、CD8+T 細胞為抑制T 細胞；CD19+細胞為總B 細胞；CD3?CD16+CD56+細胞為NK 細胞。

1.2.2.2 外周血Treg 檢測 取100 μL EDTA 抗凝外周血熒光抗體標記Treg，所用抗體包括BD 公司HLA?DR? FITC、CD4?PE?Cy7、CD45?PerCP?Cy5.5和BD Phamingen 公司CD25?PE、CD127? PE?Cy7，標本處理過程同前。CD3+CD4+CD25+CD127?細胞為外周血總Treg 細胞，測定Treg 細胞在CD4+T細胞中的比例。射門策略見圖1。

圖1 流式細胞術外周血Treg 射門策略Figure 1 Gating strategy of Treg by flow cytometry

1.2.2.3 外周血細胞因子檢測 細胞因子試劑盒購自江西賽基生物技術有限公司，檢測方法為多重熒光免疫微球法，所測細胞因子包括：IL?1β、IL?2、IL?4、IL?5、IL?6 、IL?8 、IL?10、IL?12P70 、IL?17A、IFN?γ、TNF?α 、IFN?α。EDTA 抗凝外周血離心后取上清血漿，按照說明書步驟進行處理，BD FACS Aria Ⅱ流式細胞儀檢測。根據標準曲線計算血漿標本中各細胞因子水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計軟件進行統計分析。計數資料用n（%）表示，行χ2檢驗。計量資料符合正態分布以（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗；不符合正態分布資料采用非參數檢驗，組間比較采用Kruskal?Wallis 秩和檢驗（H檢驗）。外周血Treg、淋巴細胞亞群、細胞因子與不同病因血小板減少病例組血小板水平關系，采用Pearson相關性分析。以P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組患者基線臨床資料比較

各組年齡、性別、病程、嚴重出血情況及合并用藥，基線比較差異無統計學意義（P>0.05）。對照組血小板計數顯著高于三組研究組患者，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組基線臨床資料比較［（±s），n（%）］Table 1 Comparison of baseline clinical data in each group［（±s），n（%）］

表1 各組基線臨床資料比較［（±s），n（%）］Table 1 Comparison of baseline clinical data in each group［（±s），n（%）］

注：AML：急性髓系白血病，GC：糖皮質激素；IS：免疫抑制劑；R：利妥昔單抗，SLE：系統性紅斑狼瘡；pSS：原發性干燥綜合征；ANA：抗核抗體。

性別年齡（歲）疾病分類病程（年）血小板（×109/L）嚴重出血合并用藥女性男性CTD?TP（n=21）16（76）5（24）55.1±19.7 SLE 12（57）pSS 9（43）4.53±3.0 28.35±15.6 3（14）GC 16（76）IS 18（86）ITP（n=20）14（70）6（30）52.55±20.3 ANA+ 6（30）5.15±4.29 35.45±12.3 4（20）GC 14（70）R 8（40）HD?TP（n=20）12（60）8（40）58.1±18.5 AML 20（100）6.9±5.28 27.6±14.7 4（20）GS 17（85）IS 18（90）對照組（n=30）27（90）3（10）48.17±15 4.97±3.78 218±56.93 F/Z 值2.175 1.333 1.167 60.9 1.231 1.388 P 值0.097 0.269 0.327 0.000 0.317 0.251

2.2 各組外周血Treg、淋巴細胞亞群比較

CTD?TP 組和ITP 組的Treg 在CD4+T 細胞中的比例均低于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；HD?TP 組的Treg 高于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；CTD?TP 組和HD?TP 組的總T細胞、CD4+T 細胞和NK 細胞絕對計數均明顯低于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；ITP組總T 細胞高于HD?TP 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組外周血Treg 和淋巴細胞亞群比較（±s）Table 2 Comparison of peripheral blood Treg cells and Lymphocyte subsets between groups with different causes of thrombocytopenia（±s）

表2 各組外周血Treg 和淋巴細胞亞群比較（±s）Table 2 Comparison of peripheral blood Treg cells and Lymphocyte subsets between groups with different causes of thrombocytopenia（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與HD?TP 組比較，bP<0.05；與ITP 組比較，cP<0.05。

組別Treg/CD4+T（%）總T 細胞（/μL）CD8+T 細胞（/μL）CD4+T 細胞（/μL）NK 細胞（/μL）B 細胞（/μL）CTD?TP 組（n=21）4.89±1.38abc 908±366abc 379±377abc 464±192abc 120±86.55abc 212±7.45abc ITP 組（n=20）5.74±1.42ab 1 101±512ab 371±180ab 622±333ab 242±163ab 183±127ab HD?TP 組（n=20）8.58±1.59a 806±318a 314±207a 453±219a 122±93a 122±79.55a對照組（n=30）6.59±2.11 1 293±377 483±203 711±240 362±220 210±86.2 F 值17.059 7.189 2.339 6.081 12.942 3.206 P 值0.000 0.000 0.23 0.001 0.000 0.027

2.3 不同組間外周血細胞因子結果

CTD?TP 組IL?6，IL?8 高于對照組，ITP 組IL?6，IL?8，IL?10，IL?1β，IL?17A，IFN?α，IL?12P70 高于對照組，HD?TP 組IL?8，IL?10 高于對照組，CTD?TP組IL?8，IL?1β，IL?12P70，IL?17A 低于ITP 組，ITP組IL?17A，IL?12P70 高于HD?TP 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 不同病因組間的外周血細胞因子比較（pg/mL，±s）Table 3 Comparison of peripheral blood cytokines between different etiological groups（pg/mL，±s）

表3 不同病因組間的外周血細胞因子比較（pg/mL，±s）Table 3 Comparison of peripheral blood cytokines between different etiological groups（pg/mL，±s）

注:與對照組比較，aP<0.05;與ITP 組比較，bP<0.05；與HD?TP 組比較，cP<0.05。

指標IL?2 IL?4 IL?5 IL?6 IL?8 IL?1β IL?17A IL?10 TNF?α IFN?α IL?12P70 IFN?γ CTD?TP 組(n=21)1.5±0.86 2.1±1.33 0.58±0.38 8.75±7.93a 5.5±2.28ab 1.78±1.25b 13.99±8.06b 1.93±0.65 1.52±0.93 1.91±1.17 2.38±1.82b 1.57±0.96 ITP 組(n=20)1.57±0.77 1.54±0.69 0.96±0.51 13.56±4.06a 10.19±5.33a 3.39±1.61a 16.34±7.14ac 4.27±3.6a 1.75±0.85 3.49±1.97a 3.93±1.27ac 2.13±1.04 HD?TP 組(n=20)0.99±0.72 1.37±0.97 0.55±0.32 5.79±3.48 7.09±3.99a 2.36±2.01 8.98±5.15 2.22±0.82a 2.05±1.24 1.89±1.23 2.81±0.34 1.95±0.63對照組(n=30)1.10±1.05 1.61±1.13 0.79±0.56 2.50±1.63 3.43±1.65 1.31±1.17 8.23±5.49 1.68±0.93 1.37±1.19 1.16±0.86 1.71±1.14 1.86±1.15 F 值2.22 1.75 3.52 8.50 16.12 8.04 18.7 8.87 1.75 12.49 4.87 1.11 P 值0.09 0.16 0.18 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.16 0.00 0.00 0.35

2.4 外周血Treg，淋巴細胞亞群，細胞因子與不同病因血小板減少病例組血小板相關性分析

在CTD?TP 組患者中，相關性分析結果顯示Treg 細胞比例、NK 細胞絕對值與血小板計數成正相關，血漿IL?6、IL?8、1L?17A 水平與血小板計數成負相關（P<0.05）。見表4。

表4 外周血Treg、淋巴細胞亞群、細胞因子與血小板水平相關性Table 4 Platelet correlation analysis between peripheral blood Treg，Lymphocyte subsets cytokines and thrombocytopenia of different causes in the case groups

3 討論

本研究結果顯示在不同病因引起的血小板減少患者中，均存在不同程度的免疫細胞亞群紊亂和細胞因子水平異常。與對照組相比，CTD?TP 組和HD?TP 組的外周血CD3+總T 細胞、CD4+T 細胞、NK 細胞及Treg 在CD4+T 細胞中的比例均降低，而這兩組之間無統計學差異；細胞因子比較結果顯示CTD?TP 組和ITP 組血漿IL?6、IL?8、IL?17A水平較對照組升高，而兩組的IL?8、IL?1β 和IL?17A 水平有統計學差異。相關分析發現在CTD?TP 組，Treg 細胞比例、NK 細胞絕對值與血小板計數成正相關，血漿IL?6、IL?8、1L?17A 水平與血小板計數成負相關。薩仁娜等［9］研究顯示，在老年免疫性血小板減少患者存在淋巴細胞減少，本研究結果顯示在ITP 組和CTD?TP 組CD4+T 淋巴細胞的數量均減少，Treg 細胞降低，這點與文獻研究一致。既往文獻報道Treg 細胞降低導致自身反應性T 淋巴細胞過度增生，從而產生抗GPⅡb/ⅢalgG血小板抗體的產生，導致免疫性血小板減少［4］。本研究中細胞因子組間比較結果顯示，IL?6，IL?8 在CTD?TP 組和ITP 組都高于對照組。Kimura 等［10］研究顯示IL?6 升高可阻止TGF?β 輔助的Treg 細胞分化作用，抑制Treg 細胞增殖，導致Treg 細胞降低，促進CD4+ 初始T 細胞分化為Th17，Th17分泌IL?17 促進炎癥反應參與血小板減少發病。另外本研究在原發性免疫性血小板減少（CTD?TP組）和繼發性免疫性血小板減少（ITP 組）兩組之間比較發現，IL?17A 在ITP 組高于CTD?TP 組，表明在ITP 組的Th17 細胞被激活高于CTD?TP 組，ITP患者的Th17 升高分泌了更多的IL?17A 參與血小板減少發病。文獻［11］顯示ITP 患者中樹突狀細胞能夠分泌IL?6 和IL?23 以誘導Th17 產生過多，導致Th17/Treg 失衡，因此推斷ITP 中Th17 增多導致Th17/Treg 失衡的原因，而CTD?TP 組Treg 細胞減少更明顯，更傾向于是Treg 數量減少導致的Th17/Treg 失衡。Takahashi 等［12］研究結果顯示，在基因水平上，慢性ITP 組Treg 細胞、Th1/Th2 比值顯著高于對照組，Treg 細胞及Th1/Th2 比值與血小板計數呈負相關，而Treg 細胞的降低又是導致Th1/Th2 比值失調的原因之一。

通過本研究結果表明免疫相關血小板減少患者體內免疫系統存在Treg 細胞減少、Th17/Treg 比例失衡、淋巴細胞亞群及細胞因子異常，在CTD 組Treg 細胞降低和IL?6、IL?8、1L?17A 升高與血小板計數存在正相關關系。