糖尿病腎病患者外周血lncRNA PACER表達(dá)與炎癥反應(yīng)及腎功能進(jìn)展的關(guān)系

張秀云 侯鳳英 劉美 胡文靜 王麥 雷敏

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是2 型糖尿病常見的并發(fā)癥之一，表現(xiàn)為白蛋白尿及腎功能減退［1?2］。炎癥反應(yīng)是貫穿DN 發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)環(huán)節(jié)，涉及多種炎癥細(xì)胞因子的異常釋放，單獨依靠某一種或幾種炎癥細(xì)胞因子無法準(zhǔn)確且全面的評估DN 病情［3］。近些年相關(guān)的基礎(chǔ)研究關(guān)注長鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，ln?cRNA）在炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用，李海燕［4］的細(xì)胞實驗在腎小管上皮細(xì)胞中證實高糖促進(jìn)lncRNA PACER 的表達(dá)，轉(zhuǎn)染siRNA 抑制lncRNA PACER的表達(dá)顯著抑制高糖誘導(dǎo)的多種炎癥細(xì)胞因子釋放，提示lncRNA PACER 的高表達(dá)可能參與DN 的發(fā)病。本研究將以DN 患者為對象，分析lncRNA PACER 表達(dá)與炎癥反應(yīng)及腎功能進(jìn)展的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2018年1月至2020年5月期間在石家莊市第二醫(yī)院診斷為DN 的2 型糖尿病患者作為DN 組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合指南中2 型糖尿病及DN 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；②符合指南中慢性腎臟病1～3 期的標(biāo)準(zhǔn)［5］；③按要求留取本研究所需外周血及血清標(biāo)本；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型糖尿??；②合并原發(fā)性腎臟疾病或有腎毒性藥物治療病史；③合并糖尿病急性并發(fā)癥。選擇同期就診的尿白蛋白水平及腎功能正常的2 型糖尿病患者作為DM 組，同期體檢的健康志愿者作為對照組。DN 組共72 例，包括男性40 例、女性32 例，年齡平均（60.39±10.39）歲；DM 組共80 例，包括男性48 例、女性32 例，年齡平均（60.11±10.24）歲；對照組共88例，包括男性50例、女性38例，平均年齡（59.32±9.29）歲。三組間一般資料的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本研究取得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，獲得入組研究對象的知情同意。

1.2 外周血lncRNA PACER 表達(dá)水平的檢測

取三組受試者的空腹外周靜脈血3～4 mL，采用全血RNA 提取試劑盒（北京全式金公司）提取RNA，然后采用lncRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京天根生化公司）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后采用lncRNA 熒光定量檢測試劑盒（北京天根生化公司）對cDNA 中的lncRNA PACER 進(jìn)行熒光定量PCR 擴增和檢測。反應(yīng)體系參照試劑盒說明書配置，反應(yīng)程序為95℃3 min、而后95℃15 s 60℃30 s 72℃30 s 重復(fù)40 個循環(huán)。完成擴增反應(yīng)得到循環(huán)曲線和循環(huán)閾值（Ct），在公式2?ΔΔCt中計算lncRNA PACER 的表達(dá)水平。

1.3 血清TNF?α、IL?1β、ICAM?1 含量的檢測

取三組受試者的空腹外周靜脈血5～6 mL，靜置30 min 凝血后3 000 r/min、半徑5.5 cm，離心10 min，分離血清并采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（上海酶聯(lián)生物公司）檢測TNF?α、IL?1β、ICAM?1 的含量。

1.4 DN 白蛋白尿程度及eGFR 水平的評估

參照指南［5］，根據(jù)DN 患者24 h 尿白蛋白水平評估白蛋白尿程度，30～300 mg/24 h 為微量白蛋白尿、>300 mg/24 h 為大量蛋白尿；計算eGFR，≥90［mL/（min·1.73 cm2）］為CKD1 期、60～90［mL/（min·1.73 cm2）］為CKD 2 期、30～60［mL/（min·1.73 cm2）］為CDK 3 期。

1.5 腎功能不良進(jìn)展的隨訪及評估

采用門診或住院復(fù)查、電話或網(wǎng)絡(luò)回訪等方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止時間為2021年10月31日，與入組時比較，血肌酐水平加倍或進(jìn)行腎臟替代治療判斷為腎功能不良進(jìn)展。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗、符合正態(tài)分布，用（）表示，兩組間比較采用t檢驗，兩兩比較采用LSD?t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。腎功能不良進(jìn)展的累積發(fā)生率采用K?M 曲線描述，采用log?rank 檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組lncRNA PACER 表達(dá)水平及血清炎癥因子含量的比較

外周血中l(wèi)ncRNA PACER 的表達(dá)水平及血清中TNF?α、IL?1β、ICAM?1 的含量的三組間比較如下：DN 組>DM 組、DN 組>對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；DM 組與對照組比較的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組lncRNA PACER 表達(dá)水平及血清炎癥因子含量的比較（±s）Table 1 Comparison of lncRNA PACER level and serum inflammatory factor content in each group（±s）

表1 各組lncRNA PACER 表達(dá)水平及血清炎癥因子含量的比較（±s）Table 1 Comparison of lncRNA PACER level and serum inflammatory factor content in each group（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與DM 組比較，bP<0.05。

組別DN 組DM 組對照組F 值P 值n 72 80 88 lncRNA PACER 1.21±0.23ab 1.06±0.18 1.00±0.17 14.822 0.000 TNF?α(ng/mL)8.51±1.32ab 5.68±0.86 4.01±0.77 23.811 0.000 IL?1β(ng/mL)12.74±2.03ab 9.15±1.86 7.24±1.62 17.582 0.000 ICAM?1(ng/mL)225.41±36.85ab 172.57±27.38 125.52±18.12 19.508 0.000

2.2 DN 組中不同白蛋白尿程度患者lncRNA PACER 表達(dá)水平及血清炎癥因子含量的比較

DN 組中大量白蛋白尿患者外周血中l(wèi)ncRNA PACER 的表達(dá)水平及血清中TNF?α、IL?1β、ICAM?1的含量均高于微量白蛋白尿患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 DN 組中不同白蛋白尿程度的患者lncRNA PACER 表達(dá)水平及血清炎癥因子含量的比較（±s）Table 2 Comparison of lncRNA PACER expression level and serum inflammatory factor content in patients with different degrees of albuminuria in DN group（±s）

表2 DN 組中不同白蛋白尿程度的患者lncRNA PACER 表達(dá)水平及血清炎癥因子含量的比較（±s）Table 2 Comparison of lncRNA PACER expression level and serum inflammatory factor content in patients with different degrees of albuminuria in DN group（±s）

白蛋白尿程度大量白蛋白尿微量白蛋白尿t 值P 值n 30 42 lncRNA PACER 1.31±0.30 1.14±0.27 2.215 0.014 TNF?α(ng/mL)10.61±2.03 7.01±1.25 9.300 0.000 IL?1β(ng/mL)15.29±3.41 10.92±2.52 6.257 0.000 ICAM?1(ng/mL)271.75±35.68 192.31±31.28 10.018 0.000

2.3 DN 組中不同eGFR 患者lncRNA PACER 表達(dá)水平及血清炎癥因子含量的比較

DN 組患者外周血中l(wèi)ncRNA PACER 的表達(dá)水平及血清中TNF?α、IL?1β、ICAM?1 的含量比較：CKD3 期>CKD2 期>CKD1 期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 DN 組中不同eGFR 患者lncRNA PACER 表達(dá)水平及血清炎癥因子含量的比較（±s）Table 3 Comparison of lncRNA PACER expression level and serum inflammatory factor content in patients with different EGFR in DN group（±s）

表3 DN 組中不同eGFR 患者lncRNA PACER 表達(dá)水平及血清炎癥因子含量的比較（±s）Table 3 Comparison of lncRNA PACER expression level and serum inflammatory factor content in patients with different EGFR in DN group（±s）

注：與CKD1 期比較，aP<0.05；與CKD2 期比較，bP<0.05。

eGFR 水平CKD1 期CKD2 期CKD3 期F 值P 值n 17 34 21 lncRNA PACER 1.09±0.29 1.21±0.27a 1.31±0.32ab 14.952 0.000 TNF?α(ng/mL)6.22±1.41 8.36±1.85a 10.61±2.09ab 22.812 0.000 IL?1β(ng/mL)9.85±2.05 12.42±2.62a 15.60±2.85ab 19.382 0.000 ICAM?1(ng/mL)180.15±30.58 219.57±38.12a 271.50±40.39ab 26.842 0.000

2.4 DN 組患者lncRNA PACER 表達(dá)水平與血清炎癥因子含量的相關(guān)性

DN 組患者外周血lncRNA PACER 表達(dá)水平與血清TNF?α、IL?1β、ICAM?1 的含量呈正相關(guān)（r1=0.512，r2=0.339，r3=0.452，P<0.05）。

2.5 DN 組中不同lncRNA PACER 表達(dá)水平患者腎功能不良進(jìn)展累積發(fā)生率的比較

DN 組中l(wèi)ncRNA PACER 高表達(dá)患者的腎功能不良進(jìn)展累積發(fā)生率高于lncRNA PACER 低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 K?M 曲線Figure 1 K?M curve

2.6 lncRNA PACER 表達(dá)水平預(yù)測DN 患者腎功能不良進(jìn)展的ROC 曲線分析

lncRNA PACER 表達(dá)水平預(yù)測DN 患者腎功能不良進(jìn)展的預(yù)測的ROC 曲線下面積為0.709（95%CI：0.540～0.878，P=0.022）。見圖2。

圖2 ROC 曲線Figure 2 ROC curve

3 討論

DN 是常見的2 型糖尿病并發(fā)癥之一，以白蛋白尿為主要的臨床表現(xiàn)，隨著病情發(fā)展會出現(xiàn)腎功能減退，嚴(yán)重者會進(jìn)展為終末期腎臟?。?］。因此，發(fā)現(xiàn)DN 早期防治的新靶點具有迫切的臨床需求，既要尋找早期評估DN 發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)志物，也要尋找延緩DN 發(fā)展的治療靶點。

在DN 及其他糖尿病并發(fā)癥的病理生理進(jìn)程中，涉及多種lncRNAs 表達(dá)的變化，不同的lncRNA可能通過激活炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡的方式或誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的方式參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［7?8］。國內(nèi)李海燕等［4］的研究通過細(xì)胞實驗對DN 相關(guān)的lncRNA 進(jìn)行了探索，在高糖誘導(dǎo)腎小管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的DN 細(xì)胞模型中，lncRNA PACER 表達(dá)明顯增加；轉(zhuǎn)染siRNA 抑制lncRNA PACER 的表達(dá)能夠減輕DN 細(xì)胞模型的細(xì)胞損傷。本研究通過臨床研究證實：DN 患者外周血中l(wèi)ncRNA PACER 的表達(dá)水平顯著高于DM 組和對照組，與李海燕的細(xì)胞實驗結(jié)果吻合，提示lncRNA PACER 的高表達(dá)可能與DN 的發(fā)病有關(guān)。

LncRNA PACER 具有促炎的生物學(xué)作用，國外多項研究證實該lncRNA 在帕金森病、巨噬細(xì)胞極化、多發(fā)性硬化、牙周炎等疾病中促進(jìn)炎癥反應(yīng)的激活［9?12］。TNF?α、IL?1β、ICAM?1 是目前已知與DN發(fā)病相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子［13］。既往研究及本研究均證實DN 患者血清中TNF?α、IL?1β、ICAM?1 的含量明顯增加。本研究通過相關(guān)性分析證實：DN患者外周血lncRNA PACER 的表達(dá)水平與血清TNF?α、IL?1β、ICAM?1 的含量呈正相關(guān)，提示DN發(fā)病過程中高表達(dá)的lncRNA PACER 對多種炎癥細(xì)胞因子的釋放具有促進(jìn)作用。

在DN 的發(fā)病過程中，炎癥反應(yīng)的激活、炎癥細(xì)胞因子的釋放能夠作用于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管水平細(xì)胞，引起細(xì)胞損害的同時造成白蛋白尿的產(chǎn)生或加重、腎小球濾過功能的減退［14］。本研究進(jìn)一步對DN 患者進(jìn)行了白蛋白尿程度及腎小球濾過功能的評估，分析其與lncRNA PACER 的關(guān)系可知：大量白蛋白尿的DN 患者及CKD3 期的DN 患者外周血lncRNA PACER 表達(dá)水平更高，表明DN 發(fā)病過程中高表達(dá)的lncRNA PACER 促進(jìn)了病情的加重，包括使白蛋白尿加重、腎小球濾過功能減退加重。

DN 是目前終末期腎臟病最常見的原因之一，在DN 進(jìn)展為終末期腎臟病的過程中，腎功能不斷減退［15］，因此本研究還對DN 患者腎功能進(jìn)展的情況進(jìn)行了隨訪，將血肌酐水平翻倍或發(fā)生終末期腎臟病作為腎功能不良進(jìn)展的終點事件，經(jīng)K?M 曲線分析：與lncRNA PACER 低表達(dá)的DN 患者比較，高表達(dá)的DN患者在隨訪過程中腎功能不良進(jìn)展的累積發(fā)生率更高；經(jīng)ROC 曲線分析，lncRNA PACER 的表達(dá)水平對DN患者腎功能不良進(jìn)展具有預(yù)測價值。

綜上所述，外周血lncRNA PACER 高表達(dá)與DN病情加重、炎癥反應(yīng)激活及腎功能不良進(jìn)展有關(guān)。