基于TCGA數據庫分析DARS2在膀胱癌中的臨床意義

朱翠雯 柳家翠 王萍 段怡平 陳梁玥 馬甜甜 喻明霞 范維★

膀胱癌（Bladder Cancer，BLCA）發生在膀胱黏膜上，是泌尿系統最常見的惡性腫瘤［1?2］。膀胱癌可以分為非肌肉浸潤性和肌肉浸潤性，其中前者占比70%，復發率高，且20%～30%的非肌肉浸潤性膀胱癌進展成為肌肉浸潤性［3］。5年總存活率僅為50%左右，而在遠處轉移的病例中，總存活率將低至5%［4?5］。膀胱癌的治療主要為手術，化療或二者結合，但治療預后不佳，復發率較高［6］。膀胱癌的發生與多種因素相關，包括內源性因素和外源性因素。為了能早發現，早治療，研究者對膀胱癌的分子機制進行了大量的研究。

線粒體天冬氨酰?tRNA 合成酶2（aspartyl?tRNA synthetase2，mitochondrial，DARS2）基因編碼一種線粒體tRNA 合成酶，負責線粒體蛋白質合成的第一步，將氨基酸共價連接到其同源tRNA上，確保遺傳密碼的正確翻譯［7?8］。已有的研究表明DARS2基因主要與一種稱為腦干和脊髓受累的伴乳酸升高白質腦病（leukoencephalopathy with brainstem and spinal cord involvement，and lactate elevation，LBSL）有 關［7?9］。此外，有研究表明DARS2基因通過抑制細胞凋亡和加速細胞周期，與肝癌的發展有著密切的關系［10］。然而，目前尚無研究說明DARS2基因在膀胱癌中的表達差異及意義。本研究通過下載整理癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中2020年12月31日之前納入的膀胱癌表達譜數據及患者臨床信息，分析DARS2在膀胱癌中的表達變化，探討DARS2與臨床病理特征及預后的相關性，并分析DARS2作用相關信號通路。

1 資料與方法

1.1 數據的下載與處理

在TCGA 數據庫官方網站（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載膀胱癌RNA?seq（level 3，HTSeq?FPKM）數據，其中包括膀胱癌組織樣本410 例，正常膀胱組織樣本19 例。利用R.4.0.3 軟件和Straw?berry Perl 5.32.0.1 軟件對下載的基因表達數據進行歸一化處理，并通過log2 轉化后用于后續分析。在TCGA 數據庫下載并提取膀胱癌患者的臨床病理特征信息，僅保留生存時間、生存狀態、年齡、性別、Stage 分期、T 分期、N 分期、M 分期信息均完整的患者數據。

1.2 DARS2 表達與臨床特征和預后的相關性分析

根據DARS2在膀胱癌患者中表達水平的中位值，將膀胱癌患者分為高表達組和低表達組。使用IBM SPSS Statistics 20.0 統計軟件分析DARS2表達與患者的年齡、性別、T 分期、N 分期、M 分期、Stage分期的相關性。使用OncoLnc 在線數據庫（http：//www.oncolnc.org/）分析DARS2與患者總體生存率（overall survival，OS）的關系。根據TCGA?BLCA 數據庫中膀胱癌患者的生存數據，結合DARS2的表達量，使用單因素和多因素cox 回歸分析對DARS2在膀胱癌患者中的預后價值進行研究。

1.3 DARS2 基因富集分析

使用GSEA 4.1.0 軟件進行基因富集分析。以MsigDB（Molecular Signature Database）數據庫中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 數據集作為功能基因集。采用缺省加權富集統計的方法，隨機組合次數設為1 000 次。以P<0.05 和錯誤發現率（false discovery rate，FDR）小于0.05 的基因集作為顯著富集的基因集。

1.4 統計學分析

使用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析；計數資料以n（%）表示；使用Mann?Whitney U 檢驗分析DARS2在膀胱癌樣本和膀胱正常組織樣本中的表達差異；采用卡方檢驗對DARS2表達與患者臨床特征進行相關性分析；生存分析使用Kaplan?Meier 法；cox 比例風險回歸模型用于評價DARS2的預后意義；以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DARS2 在膀胱癌組織中表達顯著上調

在TCGA?BLCA 數據集中，與正常組織相比，膀胱癌組織中的DARS2的表達顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1A。在配對組織中，腫瘤組織的DARS2表達明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1B。

圖1 DARS2 在膀胱癌組織和正常膀胱組織樣本中的表達差異Figure 1 the difference of DARS2 expression between bladder cancer and normal bladder tissues

2.2 DARS2 與膀胱癌患者臨床病理特征的聯系

DARS2在膀胱癌患者中的表達與Stage 分期（P<0.05）和T 分期（P<0.05）有關。見表1。單因素cox 回歸分析中，結果顯示，Stage 分期、T 分期、N 分期和DARS2均可以作為膀胱癌潛在的預后因素（P<0.05）；多因素cox 回歸分析結果提示，性 別（HR=0.49，95%CI：0.27～0.88，P<0.05）和DARS2（HR=2.08，95%CI：1.34～3.25，P<0.05）可以作為膀胱癌的獨立預后影響因素。見表2。

表1 DARS2 表達與膀胱癌患者臨床特征的相關性分析［n（%）］Table 1 Analysis of the correlation between DARS2 expression and clinical characteristics of patients with bladder cancer［n（%）］

表2 膀胱癌患者單因素和多因素cox 回歸分析Table 2 univariate and multivariate cox regression analysis of patients with bladder cancer

2.3 DARS2 高表達提示患者預后不良

在TCGA 數據庫中，DARS2的表達水平與患者的總生存率相關，且高表達組顯著低于低表達組，差異有統計學意義（P<0.05）（圖2A）；OncoLnc數據庫分析結果顯示DARS2的表達也與患者的總生存率相關（P<0.05）（圖2B）。

圖2 DARS2 與膀胱癌患者預后的相關性分析Figure 2 Analysis of the relationship between DARS2 and prognosis of patients with bladder cancer

2.4 GESA 富集分析結果

GSEA 分析結果顯示，DARS2主要參與了22 條信號途徑（P<0.05，FDR<0.05）。其中包括了細胞周期、RNA 降解、核苷酸切除修復、錯配修復、P53 信號通路、DNA 復制等致癌相關的途徑。見表3、圖3。

圖3 DARS2 基因高表達樣本相關富集基因集Figure 3 High expression of DARS2 gene in samples correlated with enrichment of gene sets

表3 DARS2 基因GSEA 功能富集分析結果Table 3 results of functional enrichment analysis of DARS2 gene GSEA

3 討論

膀胱癌是發生在泌尿系統的一種惡性腫瘤，已有報道表明膀胱癌的發生發展與TYRO3，TSC1，HER2，FGFR3，HOXB7等基因突變相關［4，11?14］。DARS2基因位于染色體1q25.1，編碼線粒體天冬氨酰?tRNA 合成酶，對線粒體未折疊蛋白反應（UPRmt）起重要作用［15?16］。DARS2基因編碼的蛋白屬于Ⅱ類氨基酰tRNA 合成酶家族，它是一種線粒體酶，能特異性地將天冬氨酰tRNA 氨酰化［8］。與DARS2相關的疾病主要包括腦干和脊髓受累的白質腦病和乳酸升高，大多數的LBSL 患者具有復合雜合DARS2突變［7，9，17?18］。DARS2缺失導致線粒體蛋白質合成嚴重失調，隨后線粒體呼吸鏈（MRC）大量缺失，這表明DARS2上調可能有助于提高線粒體效率［18?19］。DARS2缺失會造成心肌和骨骼肌的線粒體呼吸障礙，而DARS2的過表達則會增強呼吸功能而加速細胞的增殖分化。Kazutoshi 等［20］的研究顯示染色體上的DARS2位點通過催化與DNA A 結合的游離ATP 和ADP 之間的核苷酸交換，促進ATP?DNA A 的再生。

目前關于DARS2基因的文獻較少，而其與腫瘤相關性的研究則更是少之又少。有研究顯示DARS2是能促進肝癌細胞周期進程、促進細胞增殖、抑制肝癌細胞凋亡，并且抑制NFAT5 對肝癌細胞的促凋亡作用［10］。此外，研究者發現DARS2蛋白在肝癌組織中的表達顯著高于非腫瘤組織，提示DARS2在肝癌組織中存在上調［10］。DARS2基因敲除后細胞周期蛋白D1 的表達降低，提示DARS2促進了肝癌細胞的細胞周期進程。

本研究通過對TCGA 數據庫進行數據挖掘，發現DARS2mRNA 在膀胱癌中的表達上調，與膀胱癌的預后相關。并且利用GSEA 富集分析發現DARS2通過多種分子途徑參與膀胱癌的發生發展，研究結果提示，抑制DARS2的表達，阻斷DARS2介導的信號通路或許可以成為膀胱癌的治療策略。

綜上，DARS2在膀胱癌中存在高表達，并與腫瘤的惡性程度相關，高表達的DARS2提示預后不良。DARS2可以作為一種膀胱癌的獨立預后因素，并有望成為膀胱癌治療的新型分子靶點。