SETDB1?siRNA對卵巢癌SKOV?3細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響及其機(jī)制

葉玉錦 吳明秀 黃麗珊

卵巢癌是一種惡性程度極高的婦科腫瘤，因具有發(fā)病隱匿、早期診斷困難、腫瘤復(fù)發(fā)率高和化療耐藥性高等特點(diǎn)使其治療效果并不十分理想［1］。SET 結(jié)構(gòu)域分支型1（SET domain branch type 1，SETDB1）是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，屬于組蛋白賴氨酸N 端甲基轉(zhuǎn)移酶家族，定位于人類染色體1q21上，具有催使組蛋白H3 第9 位賴氨酸殘基（Lysine residue at position 9 of histone histone H3，H3K9）發(fā)生甲基化的作用［2］，研究發(fā)現(xiàn)SETDB1在急性髓系白血病、乳腺癌和結(jié)腸癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，能影響細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為［3］。已有研究［2］指出，SETDB1在卵巢癌組織中異常高表達(dá)，且與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究以卵巢癌細(xì)胞系SKOV?3 為研究對象，通過觀察干擾SET?DB1對SKOV?3 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibco），胎牛血清（北京沃比森），Trizol 試劑和脂質(zhì)體2000（美國Invetrogen），青霉素?鏈霉素雙抗、放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation，RIPA）裂 解 液（碧 云天），噻唑藍(lán)（Methylthiazolyldiphenyl?tetrazolium bromide，MTT）試劑和二甲基亞楓（美國Sigma），兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）單克隆抗體和鼠抗人SET 結(jié)構(gòu)域分支型1（SET domain branch type 1，SETDB1）、甘油醛?3?磷酸脫氫酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（美國Abcam），兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶?2（matrix metalloprotease，MMP?2）多克隆抗體和鼠抗人生存蛋白（survivin）、β?連環(huán)蛋白（β?catenin）、C?myc 癌基因蛋白（C?myc oncogene protein，C?myc）單克隆抗體（美國SantaCruz），辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋）。Matrigel 基質(zhì)膠、凋亡試劑盒和流式細(xì)胞儀（美國BD），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物），電化學(xué)發(fā)光（Electro?Chemi?Luminescence，ECL）顯色試劑盒（上海普飛），聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（上海根生生物），Transwell 小室（美國Costar），凝膠成像儀、電泳儀和電轉(zhuǎn)儀（美國Bio?Rad），酶標(biāo)儀（美國BioTek），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific），倒置顯微鏡（美國Olympus）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞來源及其培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞系SKOV?3 購自中科院上海細(xì)胞庫。用含10%胎牛血清、雙抗的1640 細(xì)胞培養(yǎng)基在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)SKOV?3 細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

實(shí)驗(yàn)分為對照組（Ctrl，正常培養(yǎng)）、②組（轉(zhuǎn)染陰性對照NC?siRNA）和③組（轉(zhuǎn)染SETDB1 干擾序列SETDB1?siRNA），每組設(shè)置3 個平行孔。將對數(shù)期的SKOV?3 細(xì)胞，每孔200 μL 接種至6 孔細(xì)胞板上，參照脂質(zhì)體2000 說明書根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組將SET?DB1 干擾序列SETDB1?siRNA 及其陰性對照NC?siRNA 轉(zhuǎn)染至SKOV?3 細(xì)胞中。其中，SETDB1?siRNA（5′?GACCUAUCAGGAAUGAGCA?3′，5′?UGCUCAUUCCUCAUAG?GUC?3′）和NC?siRNA（5′ ? AUGAACGUGAAUUGCUCAATT ? 3′ ，5′ ?UUGAGCAAUUCACG?UUCACTT?3′）由上海吉瑪公司合成。轉(zhuǎn)染6 h 后更換培養(yǎng)液，48 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測SETDB1mRNA表達(dá)

采用Trizol 法提取SKOV?3 細(xì)胞總RNA 后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將2 μL cDNA（模板）與10 μL SYBR Green Mix、各0.5 μL 的上下游引物、7 μL ddH2O 混勻制成終體積為20 μL 的PCR 反應(yīng)體系。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法檢測SKOV?3 細(xì)胞中SETDB1mRNA 的表達(dá)水平。其中，由上海生工生物合成的PCR 引物序列如下：GAPDH 上游：5′?GACAACTTTGGCATCGTGGA?3′，下游：5′?ATG?CAGGGATGATGTTCTGG?3′；SETDB1上 游：5′?TGAGCGAGTCATTGGGCTTT?3′，下游：5′?TCCT?GTGGTCAGGCTCACTA?3′。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

將RIPA 裂解液加待測SKOV?3 細(xì)胞中提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法進(jìn)行定量。將熱變性后的蛋白樣品上樣至聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacryl?amide gel electrophoresis，SDS?PAGE）電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加一抗工作液（SETDB1、β?catenin、c?Myc、CyclinD1、MMP?2 和Survivin）室溫孵育2 h。再經(jīng)二抗工作液（1∶2 000）室溫孵育1 h 后，參照ECL 顯色試劑盒暗室內(nèi)顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析SKOV?3 細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染48 h 后②組、③組以及未轉(zhuǎn)染的①組細(xì)胞以每孔100 μL 接種至96 孔細(xì)胞板上，分別在培養(yǎng)1、2、3 和4 d 后，加10 μL MTT 溶液（5 mg/mL）孵育4 h 后，以150 μL 二甲基亞楓。采用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在450 nm 處的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.6 Transwell 小室檢測細(xì)胞侵襲

Matrigel 溶液對Transwell 小室基底膜進(jìn)行包被，于室溫下充分凝固。將各組細(xì)胞以無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，濃度為105個/mL。上室中加細(xì)胞懸液200 μL，下室加含血清培養(yǎng)基600 μL，孵育24 h，取出小室，拭去上室內(nèi)的基質(zhì)膠，甲醛固定30 min、0.5%結(jié)晶紫染色15 min。使用倒置顯微鏡每個樣品隨機(jī)選取5 個視野，觀察并統(tǒng)計穿過濾膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

預(yù)冷的磷酸緩沖液將收集的②組、③組和①組細(xì)胞洗滌2 次后，密度為104個/mL。參照凋亡檢測試劑盒說明書上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（）形式表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SETDB1?siRNA 對SKOV?3 細(xì)胞中SETDB1表達(dá)的影響

與①組相比，轉(zhuǎn)染NC?siRNA 后SKOV?3 細(xì)胞中SETDB1mRNA 和蛋白的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），轉(zhuǎn)染SETDB1?siRNA 可使SKOV?3 細(xì)胞中SETDB1mRNA 和蛋白的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、表1。

圖1 Western blot 檢測SETDB1 蛋白的表達(dá)Figure 1 Western blot detection of SETDB1 protein expression

表1 各組細(xì)胞中SETDB1 mRNA 和蛋白表達(dá)的比較（±s）Table 1 Comparison of SETDB1 mRNA and protein expression in each group of cells（±s）

表1 各組細(xì)胞中SETDB1 mRNA 和蛋白表達(dá)的比較（±s）Table 1 Comparison of SETDB1 mRNA and protein expression in each group of cells（±s）

注：與①組相比，aP<0.05；與②組相比，bP<0.05。

組別①②③F 值P 值SETDB1 mRNA 1.00±0.00 0.96±0.05 0.31±0.03ab 261.348 0.000 SETDB1 蛋白1.18±0.09 0.97±0.06 0.28±0.03ab 475.071 0.000

2.2 SETDB1?siRNA 對SKOV?3 細(xì)胞不同時間點(diǎn)增殖的影響

轉(zhuǎn)染NC?siRNA 后SKOV?3 細(xì)胞的增殖能力與①組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），轉(zhuǎn)染SET?DB1?siRNA 后SKOV?3 細(xì)胞從2 d 開始增殖能力明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞在不同時間點(diǎn)的450 nm 處吸光度值比較Table 2 Absorbance values of cells in each group at 450 nm

2.3 SETDB1?siRNA 對SKOV?3 細(xì)胞侵襲的影響

與①組相比，轉(zhuǎn)染NC?siRNA 對SKOV?3 細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但轉(zhuǎn)染SETDB1?siRNA 可使SKOV?3 細(xì)穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2、表3。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡結(jié)果Figure 2 Flow cytometry detection results of apoptosis of cells in each group

表3 各組中穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡率Table 3 The number of transmembrane cells and the rate of apoptosis in each group

2.4 SETDB1?siRNA 對SKOV?3 細(xì)胞中Wnt/β?catenin 信號通路的影響

與①組相比，轉(zhuǎn)染SETDB1?siRNA 可明顯使SKOV?3 細(xì) 胞c?Myc、CyclinD1、MMP?2 和Sur?vivin 蛋白的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），轉(zhuǎn)染NC?siRNA 對相關(guān)蛋白蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖3 和表4。

表4 各組細(xì)胞中β?catenin、c?Myc、CyclinD1、MMP?2 和Survivin 蛋白的表達(dá)水平Table 4 Expression levels of β?catenin，c?Myc，CyclinD1，MMP?2 and Survivin proteins in cells of each group

圖3 Western blot 檢測β?catenin、c?Myc、CyclinD1、MMP?2 和Survivin 蛋白的表達(dá)結(jié)果Figure 3 Western blot detection of protein expression of β?catenin，c?Myc，CyclinD1，MMP?2 and Survivin

3 討論

目前，卵巢癌一線治療方案為放療或化療，這也是其晚期患者的主要治療方式，雖然在一定程度上取得了較大進(jìn)展，但是復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響其治療的關(guān)鍵［4］。因此，選擇有效分子基因?qū)μ岣呗殉舶┗颊呱媛手陵P(guān)重要。

SETDB1在結(jié)直腸癌中異常高表達(dá)，且上調(diào)SETDB1促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡［5］。有研究顯示，SETDB1基因敲除可通過上調(diào)SMAD7抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［6］。研究結(jié)果顯示，在肝癌組織中SETDB1高表達(dá)，下調(diào)SETDB1具有抑制肝癌細(xì)胞存活和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，而該作用是miR?621 提高肝癌細(xì)胞放射敏感性的重要機(jī)制［7］。以上結(jié)果說明SETDB1與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，之前已有研究表明SETDB1在卵巢癌中高表達(dá)［2］。本研究結(jié)果顯示，SETDB1mRNA 和蛋白表達(dá)下調(diào)，并降低卵巢癌細(xì)胞活性，減少穿膜細(xì)胞數(shù)，增加細(xì)胞凋亡率，提示SETDB1?siRNA 能抑制卵巢癌SKOV?3 細(xì)胞增殖、侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該結(jié)果與前人研究［5?6］相似。

Wnt/β?catenin 信號通路是比較經(jīng)典的信號通路，當(dāng)其激活受阻后，能抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展［8］。β?catenin 是Wnt/β?catenin 信號通路的關(guān)鍵蛋白，其在胞漿內(nèi)過度積累可進(jìn)入細(xì)胞核，使相關(guān)靶基因激活，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡等促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展［9］。c?Myc是一種原癌基因，在卵巢癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要促進(jìn)作用［10］；CyclinD1 是一種周期蛋白，也是一種促癌基因，在卵巢癌細(xì)胞增殖和周期過程有關(guān)［11］；MMP?2是一種與細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶，與卵巢癌的惡性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12］；Survivin是一種抑轉(zhuǎn)移蛋白，其過表達(dá)被認(rèn)為可能是卵巢癌的臨床病理標(biāo)志物［13］。此外，Wnt/β?catenin 信號通路的激活，能影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等生物學(xué)過程［14］。有研究［15］指出，SETDB1可通過促進(jìn)Wnt/β?catenin 通路活化促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的惡性進(jìn)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SETDB1?siRNA 轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV?3后，卵巢癌細(xì)胞中β?catenin、c?Myc、CyclinD1、MMP?2 和Survivin 蛋白下調(diào)，這提示SETDB1在卵巢癌細(xì)胞中的調(diào)控作用與Wnt/β?catenin 通路有關(guān)，并影響卵巢癌細(xì)胞的發(fā)展。

綜上所述，轉(zhuǎn)染SETDB1?siRNA 可抑制SKOV?3 細(xì)胞增殖、侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制Wnt/β?catenin 信號通路的活化。