石軍顆粒治療肝性腦病的作用機制研究

蔣潔瑩 郁韶明 劉瑾

石軍顆粒原名“清開顆?！被颉扒彘_沖劑”，由大黃、石菖蒲和敗醬草三味中藥組方而成，是上海中醫藥大學附屬曙光醫院院內制劑，能清熱解毒、豁痰開竅，主要用于治療肝炎后肝硬化引起的輕微型肝性腦病和肝性腦病?Ⅰ期及Ⅱ期［1］。方中大黃具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經的功效，為君藥；石菖蒲具有開竅豁痰，醒神益智之效，為臣藥；敗醬草能清熱解毒、利濕排膿、活血化瘀，為佐藥［2］。三藥合用起到滌蕩胃腸、清熱解毒、豁痰開竅醒神的作用。實驗研究表明石軍顆粒具有降低血氨及內毒素［3］、抑制肝細胞凋亡壞死［4］、改善神經生理功能［5］、改善學習記憶能力［6］等作用，在治療肝性腦病方面臨床療效顯著［1，3］。

肝性腦?。╤epatic encephalopathy，HE）是由肝功能紊亂和/或門體分流異常引起的大腦功能失調綜合征［7］，臨床表現為神經或精神異常［7?8］。中醫上屬于“神昏”、“郁證”等范疇，多是由外感、情志不暢、飲食不潔等方面導致的肝疏泄功能失常所致［1，5］。本研究運用公共數據平臺及生物信息學分析方式，從整體和分子層面探討石軍顆粒治療肝性腦病的作用機制及靶點，為后續研究提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/index.php）；DrugBank 數據庫（https：//go.drugbank.com/）；GEO數據庫（GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）；DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）；Omicshare（http：//www.Omicshare.com/）；Cytoscape 3.7.1 軟件；四氯化碳（CCl4）購于宜興市洋溪徐瀆化工廠。

1.2 石軍顆粒化學成分篩選及靶點預測

運用TCMSP 平臺，以“大黃”、“石菖蒲”、“敗醬草”為關鍵詞查找化學成分，同時限定參數OB≥30%和DL≥0.18 進行篩選［9］，并選取來源于Drug?Bank 的成分靶點。

1.3 疾病相關靶點收集

以“hepatic encephalopathy”為關鍵詞，在GEO數據庫中檢索，選取GSE57193 芯片，設定adjusted p?value<0.05 和|log 2（fold change）|>1 篩選得到的差異基因即為肝性腦病的相關靶點。

1.4 網絡圖構建

將篩選得到的石軍顆?；瘜W成分和靶點數據導入Cytoscape 3.7.1 軟件，構建石軍顆粒成分?靶點網絡圖。網絡圖中的節點（node）代表成分和靶點，邊（edge）代表成分和靶點之間的聯系。將石軍顆粒成分靶點和肝性腦病相關差異基因數據分別導入Cytoscape 3.7.1 軟件，利用Bisogenet 插件構建石軍顆粒和肝性腦病蛋白?蛋白相互作用（PPI）網絡圖。對PPI 網絡圖進行融合，通過設置Degree、Closeness、Betweenness、Network、Eigenvector、Local Average Connectivity?based method（LAC）等參數篩選石軍顆粒治療肝性腦病的靶點。

1.5 網絡融合

將石軍顆粒PPI 網絡和肝性腦病PPI 網絡Merge 后，選其交集進行網絡圖構建。依據文獻方法［10］，以degree centrality >68 篩選。然后進行拓撲分析，得到石軍顆粒治療肝性腦病的靶點。

1.6 石軍顆粒治療肝性腦病靶點的富集分析

將篩選得到的候選靶點導入DAVID 數據庫，進行Pathway 分析，并設置FDR<0.01 作為篩選條件。利用omicshare 繪制KEGG 通路結果氣泡圖。

1.7 動物飼養、造模及給藥

體重250～300 g 的雌性和雄性SD 大鼠，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供及飼養。飼養環境為室溫20℃，14 h 照明和10 h 黑暗。除正常組外，實驗大鼠都按0.5 mL/kg 腹腔注射CCl4，三天后按相同劑量腹腔注射30%CCl4石蠟油混合液，接下來每周注射3 次，連續3 周，造模周期一共為4 周。給藥組在造模完成后開始給藥，每日1 次灌胃給藥，連續給藥2 周。對照組給予乳果糖，正常組給予同等體積生理鹽水。

1.8 Western blot

PC12 細胞用含10%胎牛血清、5%馬血清和1%青霉素?鏈霉素的DMEM 高糖培養基培養于37℃含95%空氣和5%CO2的培養箱中。按2×106cells/孔的濃度將PC12 細胞接種于10 cm 規格的培養皿中，培養24 h。用濃度為200 μg/mL 的石軍顆粒80%甲醇提取物對細胞進行處理0.5 h，然后用4 mM 的MPP+處理24 h。用細胞裂解液提取總蛋白，加入1%的蛋白酶抑制劑和1%的磷酸酶抑制劑。用BCA 法對蛋白濃度進行測定，按蛋白定量試劑盒說明書操作。以每個點樣孔40 μg 蛋白的量進行上樣，并加入7 μL 的蛋白marker，然后進行跑膠，并轉移到聚偏二氟乙烯轉移膜上。接下來在5%的脫脂牛奶進行封閉2 h，然后在4℃環境下用β?actin（45 kDa）、Akt（60 kDa）、p?Akt（60 kDa）、JNK（46、54 kDa）、p?JNK（46、54 kDa）抗體進行過夜孵育，隨后用非特異性二抗孵育1 h。使用eECL 曝光試劑盒對膜進行曝光，最后使用熒光及化學發光成像系統測定各個蛋白的表達。

1.9 血氨和肝功能檢測

腹主動脈取血并分離血清，用全自動生化儀測定血清中谷丙轉氨酶（Alanine transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（Aspartate Transaminase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、谷氨酰轉移酶（gamma?glutamyltransferase，GGT）、白蛋白（Albumin，ALB）和球蛋白（globulin，G）含量，用血氨檢測儀檢測血氨濃度。

1.10 統計學方法

采用SPSS 20 軟件進行統計分析；正態分布、方差齊性的計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗；P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 石軍顆粒化學成分及靶點收集

去除無靶點和重復的化合物后，共篩選得到20 個石軍顆粒成分，見表1。共獲得99 個靶點。

表1 石軍顆?；瘜W成分信息Table 1 The chemical compositions of Shijun Granules

2.2 疾病相關靶點

共得到肝性腦病相關靶點305 個。

2.3 網絡圖構建

20個化學成分的degree中位數是8.5。其中degree較高的成分為quercetin、kaempferol、stigmasterol、lute?olin、beta?sitosterol；靶點包括PTGS2、NCOA2、PTGS1、AR、PRSS1。石軍顆粒成分?靶點網絡圖見圖1。

圖1 石軍顆粒成分?靶點網絡圖Figure 1 The composition?target network of Shijun Granules

2.4 網絡融合

石軍顆粒PPI 網絡和肝性腦病PPI 網絡Merge后的網絡圖，見圖2A。以degree centrality>68 篩選后的網絡圖，見圖2B。經拓撲分析后，得到石軍顆粒治療肝性腦病的207 個靶點，見圖2C。

圖2 石軍顆粒治療肝性腦病的候選作用靶點網絡圖Figure 2 Identification of candidate targets of Shijun Granules against HE

2.5 KEGG 富集分析

KEGG 分析結果中包含16 條疾病通路和4 條信號通路，主要是Viral carcinogenesis、Alcoholism、Cell cycle 和MAPK signaling pathway 等，見 圖3。建立石軍顆粒治療肝性腦病靶點?通路網絡圖，見圖4。MAPK1、AKT1、NFKB1、RELA、TP53、GRB2、EGFR 等節點也具有較大的degree 值，構建石軍顆粒治療肝性腦病關鍵靶點?成分網絡圖，見圖5。

圖3 石軍顆粒治療肝性腦病預測靶點的KEGG 分析Figire 3 The KEGG analysis of Shijun Granules against HE

圖4 石軍顆粒治療肝性腦病靶點?通路網絡圖Figure 4 The target?pathway network of Shijun Granules against HE

圖5 石軍顆粒治療肝性腦病關鍵靶點?成分網絡圖Figure 5 The key target?composition network of Shijun Granules against HE

2.6 石軍顆粒調控MAPK 和PI3K?Akt 信號通路

MPP+刺激的細胞p?JNK 蛋白表達與對照組比較顯著升高，而對JNK 蛋白的表達無明顯影響，當細胞用石軍顆粒提取物預處理后，細胞p?JNK 蛋白表達與MPP+組比較明顯降低，MPP+刺激的細胞p?AKT 蛋白表達顯著降低，而當細胞用石軍顆粒提取物預處理后，細胞p?AKT 蛋白表達明顯升高。見圖6。

圖6 石軍顆粒對MPP+誘導損傷PC12細胞蛋白表達的影響Figure 6 Effect of Shijun granules on protein expression of MPP+induced damaged PC12 cells

2.7 石軍顆粒對HE 大鼠血氨濃度和血清ALT、AST、ALP、GGT、ALB、G 含量的影響

與正常組相比，模型組動脈血氨濃度顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。當給予乳果糖和石軍顆粒后，血氨濃度顯著下降，其中給藥組具有更低的血氨水平。與正常組相比，模型組ALT、AST、ALP、GGT 和G 含量升高，當給予乳果糖后ALT、AST、ALP 和GGT 含量下降，但G 含量與模型組相比并沒有顯著降低。當模型大鼠給予石軍顆粒后，ALT、AST、ALP、GGT 以及G 含量與模型組相比都顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），其中G 含量降低到正常水平。見表2。

表2 血氨濃度和ALT、AST、ALP、GGT、ALB、G 含量比較Table 2 Comparison of blood ammonia concentration and ALT，AST，ALP，GGT，A，G content

3 討論

國內外文獻顯示肝硬化患者出現輕微肝性腦病的比率為39.9%至75%，而患輕微肝性腦病的患者病情會進展為肝性腦?。?1］。肝性腦病是肝硬化常見并發癥，也是導致肝病死亡的常見原因。肝性腦病發病機制復雜，目前尚未完全確定其發病機制，常見的機制有氨中毒、炎癥損傷、神經遞質功能損傷、錳中毒、膽汁酸升高、氧化/亞硝化應激、腸道微生物失衡、氨基酸失衡、低鈉血癥、鋅缺乏、腦能量代謝失衡、腦干網狀系統損傷等［11?14］。因此肝性腦病相關的治療策略主要是從祛除誘因著手，如：降氨、抗感染、飲食調節、肝移植等［15］。中醫學研究認為肝性腦病的病機是熱、毒、痰、瘀互結，導致腑氣不通，腦竅蒙蔽，治療應以清熱解毒、涼血化瘀為主。

石軍顆粒由大黃、石菖蒲和敗醬草組方而成，在治療肝性腦病方面具有較好的臨床療效。自2000年在臨床應用以來，前后進行了多次臨床研究，探討了石軍顆粒經口服或灌腸給藥后在治療輕微肝性腦病、肝性腦病、肝硬化合并肝性腦病、代償期肝硬化輕微肝性腦病、慢性肝病后肝硬化并發輕微型肝性腦病等疾病方面的臨床療效，但其治療肝性腦病的作用機制仍未明確。本研究應用公共數據平臺及生物信息學分析方法，基于分子層面和整體角度探究石軍顆粒治療肝性腦病的作用機制，將成分和疾病相關靶點進行關聯，運用多靶點，多成分的研究模式，對化合物對疾病的作用機制及藥理作用進行分析。研究結果顯示石軍顆?？赡苁峭ㄟ^調控MAPK、PI3K?Akt、ErbB、HIF?1等信號通路發揮作用；MAPK1是石軍顆粒治療肝性腦病的核心靶點，AKT1、NFKB1、RELA、TP53、GRB2、EGFR等為關鍵靶點；石軍顆粒通過調控MAPK1、AKT1、NFKB1等基因的表達和轉錄以及通過對相關靶點的作用，調控相關信號通路。網絡藥理學的研究對于探究石軍顆粒治療肝性腦病的作用機制、重要靶點以及活性成分等有一定幫助。但是由于數據庫涵蓋信息的局限、篩選條件的限定以及成分和靶點的復雜性，使得研究結果具有一定的片面性。本研究通過分子生物學的實驗進行驗證，明確了MAPK 和PI3K?Akt 信號通路是石軍顆粒發揮作用的機制。同時，動物實驗表明，石軍顆?？捎行Ц纳艸E 大鼠肝功能，降低動脈血氨濃度。因此，推斷石軍顆粒可能通過調控MAPK 和PI3K?Akt 信號通路改善肝性腦病患者的肝功能，降低由氨誘導的腦細胞腫脹和氧化應激，發揮治療肝性腦病的作用。