非小細胞肺癌c?MET、BRAF、ROS1基因突變與臨床特征的關系

周榮根 王燕 陳基升 董森森

肺癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，有著較高發病率和死亡率，其中以非小細胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）最為常見，其占所有肺癌類型的80%～85%，包括腺癌、鱗癌、腺鱗癌等。早期診治有助于控制病情發展，延長患者生存期［1］。近年來，隨著對肺癌發病機制及其生物學行為研究的不斷深入，臨床日益聚焦以特異性高、副作用小為特征的基因分子靶向治療。靶向基因測序是一種很有前景的檢測方法和手段，可為基因檢測降低材料使用和減少檢測時間。常規檢測ALK、ROS1基因突變在晚期NSCLC 診治中已成為診斷共識。研究發現，除這些基因突變外，c?MET基因突變也是NSCLC 發生及對EGFR?TKI 藥物耐藥的一個機制［2］。本研究通過檢測確診為NSCLC 患者病灶組織中c?MET、BRAF、ROS1基因突變表現，并與臨床病理特征的關系，為臨床靶向診治提供潛在新靶點和依據，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取南陽市第二人民醫院胸外科2019年1月至2022年2月診治的82 例NSCLC 初診患者，均為經影像學、病理學檢查等確診，符合《肺癌篩查與管理中國專家共識》相關診斷標準［3］。其中，男性44例，女性38 例；平均年齡（56.9±5.6）歲；病理類型：腺癌69 例，鱗癌13 例；腫瘤分期：Ⅰ期14 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期35 例，Ⅳ期10 期；吸煙史：有48 例，無34 例；淋巴轉移：有39 例，無43 例；腫瘤侵潤深度：T1 14 例，T2 20 例，T3 30 例，T4 18 例。納入標準：①年齡≥18 歲；②肺癌TNM 分期為Ⅰ～Ⅳ期；③均接受手術或病理檢查；④臨床依從性良好；⑤所有患者對研究知情并同意。排除標準：①伴精神障礙或意識不清楚者；②預計生存期<3 個月者；③臨床資料不全者；④有藥物過敏史者。收集所有患者手術切除或穿刺活檢石蠟包埋病灶組織切片標本。收集所有患者手術切除或穿刺活檢石蠟包埋病灶組織切片標本。本研究經院倫理委員會批準。

1.2 方法

①提取：根據試劑盒說明書，使用QIAamp DNA微量核酸提取試劑盒（Qiagen, Heidelberg, Germa?ny）和QIAamp DNA FFPE 組織試劑盒（Qiagen,Heidelberg, Germany）從冷凍組織和FFPE 樣本中提取DNA。 使用NanoDrop1000 分光光度計（NanodropTechnologies，Wilmington，USA）和Qubit量子熒光計（Invitrogen，Carlsbad，USA）對DNA 濃度進行定量。利用安捷倫2100 生物分析儀（Agi?lent，Saint Clara, USA）使用高靈敏度DNA 試劑評估碎片狀態，以產生DNA 完整性數（DIN）。此外，還進行了質量控制（QC）步驟，以通過多重聚合酶鏈反應（PCR）評估FFPE DNA 的完整性。②針對靶向基因測序，定制了一個由23 個腫瘤相關基因組成的panel。通過E220 聚焦超聲儀Covaris（Covaris，Woburn，MA，USA）對每個樣本中的300納克gDNA 進行機械破碎和片段化。DNA 片段的目標大小在150 到200 bp 之間。然后，使用KAPA文庫制備試劑盒（KAPA Biosystems Inc.，Wilming?ton，USA）將10?100 ng DNA 用于文庫構建，按照該試劑盒制造商的說明，通過末端修復、加A 拖尾和接頭連接構建。最后，使用xGen 鎖定探針池（IDT 技術）捕獲NGS 文庫，并使用1×KAPA HiFi熱啟動Ready Mix 通過12?13 個PCR 周期擴增捕獲的DNA 片段。然后在Illumina Nova 測序儀上使用150PE 模式對文庫產物進行測序。以>3000×的平均覆蓋率對FFPE 樣本和>200×的平均覆蓋率對配對的樣本進行測序，并記錄相關數據。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件包進行數據分析；計數資料以n（%）表示，通過卡方檢驗、Fisher 精確檢驗對各基因與臨床病理特征進行組間比較；以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者c?MET、BRAF、ROS1 基因突變情況

病理HE 染色見圖1，可見腫瘤細胞呈簇狀、片狀或散在排列，胞核染色質粗糙、核仁清晰，胞質豐富。c?MET基因突變占比36.59%，BRAF基因突變占比15.85%，ROS1基因突變占比6.10%；c?MET與ROS1基因突變共存有1 例，占比1.22%。見表1。

圖1 NSCLS 病灶組織HE 染色圖（HE 染色，×400）Figure 1 HE staining of NSCLS focal tissues（HE staining，×400）

表1 NSCLS患者c?MET、BRAF、ROS1基因突變比例［n（%）］Table 1 Proportion of c?MET，BRAF and ROS1 gene mutations in NSCLS patients［n（%）］

2.2 c?MET 基因突變與臨床病理特征的關系

c?MET基因突變型與野生型在性別、年齡、腫瘤分期、病理類型方面比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 c?MET 基因突變和NSCLC 病理特征的關系［n（%）］Table 2 Relationship between c?MET gene mutation and PATHOLOGICAL features of NSCLC［n（%）］

2.3 BRAF 基因突變與臨床病理特征的關系

BRAF基因突變型的腫瘤侵潤深度整體低于野生型，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 BRAF 基因突變和NSCLC 病理特征的關系［n（%）］Table 3 Relationship between BRAF gene mutation and PATHOLOGICAL features of NSCLC［n（%）］

2.4 ROS1 基因突與臨床病理特征的關系

ROS1基因突變型的男性占比、年齡、有吸煙史占比、鱗癌及腺癌及臨床Ⅲ期、Ⅳ期占比均低于野生型，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

表4 ROS1基因突變與NSCLC臨床病理特征的關系［n（%）］Table 4 Relationship between ROS1 gene mutation and clinicopathological features of NSCLC［n（%）］

3 討論

當前，臨床采取的個體化靶向治療主要是針對EGFR突變型的NSCLC，此種NSCLC 有著明確的基因靶點及相關檢測技術、靶向藥物，臨床治療效果提升。之后在肺癌中越來越多驅動基因被發現，包括ROS1、c?MET、BRAF等。

ROS1是一種酪氨酸激酶胰島素受體基因，已在數種腫瘤細胞株中檢測出高表達［4?5］。其染色體重排是NSCLC 一個新亞型，為獨特的受體酪氨酸激酶，在進化上和ALK 有著密切關系［6］。有研究表明［7］，小分子酪氨酸激酶抑制劑對ROS1基因重排具有較顯著的的抗腫瘤活性，ROS1能夠作為潛在的靶向治療分子。本研究結果表明女性、年齡≤60 歲、吸煙者、晚期腺癌患者的ROS1基因突變率較高。從臨床病例看，ROS1突變患者多見于年輕患者，與文獻報道基本一致［8］。

目前，c?MET基因已成為NSCLC 靶向治療的新熱點［9］。在NSCLC 中，c?MET蛋白異常活化可通過多種機制發生。臨床研究認為c?MET基因突變與NSCLC 患者的性別、年齡、吸煙狀態、腫瘤組織類型和臨床分期無相關性［10］，但本研究發現c?MET基因突變與患者與性別、年齡、腫瘤分期、病理類型有關。但c?MET基因的突變、擴增、表達等概率較低，研究顯示［11］，c?MET基因發生14外顯子跳躍性突變與擴增概率僅2%～6%與1%～5%。

BRAF基因作為RAF基因家族中重要一員，其基因突變類型以V600E 常見，在BRAF突變中可占大約90%［12］。本研究發現，BRAF基因在腫瘤浸潤深度T3、T4 患者中突變率較高。相關研究表明［13］，BRAF基因突變型NSCLC 患者無法從抗EGFR 單抗治療中獲益，且BRAF基因突變的轉移性NSCLCD 預后差，突變患者無進展生存期和總生存期較野生型的患者明顯縮短。有研究對NSCLC 患者進行基因檢測，發現BRAF與ALK雙基因突變發生率約0.3%［14］。

一般認為，同一患者中ROS1融合基因突變與c?MET基因突變不共存，但近期隨著ROS1基因與c?MET基因檢測的推廣及檢測人群增加，相繼出現兩者基因突變共存個案報道，大部分為女性，無吸煙史，病理類型大部分為腺癌較年輕患者。本研究中，c?MET與ROS1基因突變共存為1.22%，與相關報道相符。與傳統觀點認為ROS1融合基因會導致c?MET突變患者對酪氨酸激酶抑制劑耐藥不同，研究顯示對c?MET和ROS1共存突變患者加用相應抑制劑治療，可提高患者的總體生存率。本研究結果意味著部分NSCLC 患者可用靶向藥克唑替尼治療。

綜上，c?MET基因突變易發生于女性、年齡≤60歲以及不吸煙及腺癌的患者，ROS1基因突變好發于腺癌患者，BRAF可能與腫瘤侵潤深度有關。