胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒評價

曲守方 黃傳峰 于婷 黃杰

胚胎植入前非整倍體篩查（preimplantation ge?netic testing for aneuploidy，PGT?A）是對體外受精的胚胎，進行染色體非整倍性及染色體拷貝數變異（Copy number variants，CNV）檢測，篩選正常的胚胎植入子宮的一種早期篩查方法，能夠提高種植率、妊娠率及活產率。1993年首次報道了經胚胎植入前遺傳學篩查（Preimplantation genetic Screening，PGS）后獲得成功妊娠的病例，這項技術的臨床應用性逐漸拓展［1?2］。目前PGS 檢測方法主要包括熒光原位雜交（fluorescence in situ hybrid?ization，FISH）、比較基因組雜交技術（comparative genomic hybridization，CGH）和高通量測序（next generation sequencing，NGS）等方法［3?4］。其中高通量測序技術已經成為臨床上使用較多的胚胎染色體分析技術，多項臨床對照試驗均表現出胚胎經染色體篩查后妊娠率有所提高［5］。

目前國內已經有多家公司開發基于高通量測序技術的胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒。中國食品藥品檢定研究院于2017年研制胚胎植入前染色體非整倍體國家參考品，用于胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒上市前的注冊檢測。2019年國家藥品監督管理局批準YY/T 1657?2019 胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（測序法）行業標準的發布，用于規范該類產品的標準。本研究使用胚胎植入前染色體非整倍體國家參考品，評價基于半導體測序法的胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒的質量。

1 材料與方法

1.1 樣本

胚胎植入前染色體非整倍體國家參考品，中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 試劑與儀器

胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（半導體測序法）和測序反應通用試劑盒（半導體法），購自東莞博奧木華基因科技有限公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit 購自美國Invitrogen 公司；PCR 擴增儀，型號：Veriti，購自美國Thermo Fisher 公司；熒光定量儀，型號：Qubit 3.0，購自美國Life Technology 公司；熒光定量QPCR 儀，型號：StepOne Plus，購自美國ABI 公司；基因測序儀，型號BioelectronSeq 4000，購自東莞博奧木華基因科技有限公司。

1.3 方法

按照胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（半導體測序法）的說明書，取國家參考品置于Veriti 型PCR 擴增儀進行細胞裂解及片段化，并制備文庫。將文庫進行PCR 擴增和單細胞擴增后純化。純化的DNA 使用Qubit 3.0 熒光定量儀和Qubit dsDNA HS Assay Kit 進行定量，樣本的濃度要求≥20 ng/μL，確定單細胞擴增是否成功。將純化的單細胞擴增DNA 繼續進行片段化和純化后，進行末端修復、接頭連接以及PCR 擴增等步驟，構建文庫。將文庫純化后，使用StepOne Plus 熒光定量QPCR 儀和試劑盒的定量標準品進行文庫定量。按照文庫上機濃度的要求，混合各個文庫。

按照測序反應通用試劑盒（半導體法）說明書，混合文庫使用基因測序儀BioelectronSeq 4 000進行測序。使用試劑盒配套的全自動分析軟件對測序數據進行生信分析，從而識別染色體拷貝數變異。計算比對到基因組中的測序讀長數并歸一化成拷貝數值；然后采用環狀二元分割算法（Cir?cular Binary Segmentation，CBS）識別染色體拷貝數的斷點位置，進而將染色體分段（segment）并計算每個分段的平均拷貝數值（CBS Ratio），最后統計各染色體分段的Z?score 和顯著性水平。CBS Ratio 值的顯著性水平（P?value）采用R 軟件（版本3.4.1）進行統計分析，利用t?檢驗計算P?value。將Z?score 大于3 或小于?3、且P?value 小于0.0001 的染色體分段判斷為染色體拷貝數變異陽性。

2 結果

2.1 陽性參考品結果

對于65 個異常片段大于4 Mb 的國家陽性參考品，試劑盒均能檢出對應的染色體異常，檢出率為100%。國家陽性參考品19?del（7）?25.3M 在7號染色體100.5 Mb?125.8 Mb 位置存在片段大小約25.3 Mb 的拷貝數缺失，其Z?score 為?28.6。見圖1；其他國家陽性參考品的相應異常區域對應的染色體Z?score 均>3 或3或

圖1 國家陽性參考品19?del（7）?25.3M 的結果Figure 1 The result of nationalpositive reference for 19?del（7）?25.3M

圖2 國家陽性參考品（異常片段大于4Mb）結果Figure 2 The result of national positive reference materials（abnormal fragments>4 Mb）

圖3 國家陽性參考品22?del（7）?1.5M 的結果Figure 3 The result of national positive reference for 22?del（7）?1.5M

圖4 國家陽性參考品（異常片段小于等于4 Mb）結果Figure 4 The result of national positive reference materials（abnormal fragments ≤4 Mb）

2.2 陰性參考品結果

10 個國家陰性參考品均未檢出試劑盒范圍內的染色體異常，其Z?score 均小于3 且大于0，顯著性水平P?value>0.0001，如國家陰性參考品97?NC1在1?22 號染色體和性染色體區域內均未檢測出異常區域。見圖5、圖6。

圖5 國家陰性參考品97?NC1 結果Figure 5 The result of national negative reference material for 97?NC1

圖6 國家陰性參考品結果Figure 6 The result of national negative reference materials

2.3 嵌合體參考品結果

對30%嵌合的嵌合體樣本檢出率為50%（3/6），相對應的70%嵌合體樣本檢出率為83.3%（5/6）。見圖7。國家嵌合體參考品110?0.3?del（4）?37.7M是兩種細胞不同比例的混合，30%嵌合比例細胞在4 號染色體153.1 Mb?190.8 Mb 位置存在大小約37.7 Mb 拷貝數缺失，其Z?score 為?16.5；70%嵌合比例細胞在15號染色體23.6 Mb?28.5 Mb位置存在大小約4.9 Mb 拷貝數缺失，其Z?score 為?10.5，結果顯示30%嵌合和70%嵌合的細胞均正確檢出。見圖8。

圖7 國家嵌合體參考品結果Figure 7 The result of national chimera reference materials

圖8 國家嵌合體參考品110?0.3?del（4）?37.7M 結果Figure 8 The result of national chimera reference material for 110?0.3?del（4）?37.7 M

3 討論

在體外受精形成的胚胎中，約50%存在染色體異常，可導致移植后早期胚胎丟失、自然流產和死產，是限制輔助生殖技術成功率和有效推廣的重要原因之一。基于高通量測序的胚胎植入前染色體非整倍體檢測，檢測胚胎卵裂球細胞或者囊胚滋養層細胞的DNA，獲得樣本中23 對染色體數量的差異，對胚胎染色體非整倍體或部分染色體拷貝數變異進行植入前輔助診斷，選擇正常胚胎植入子宮，從而提高輔助生殖的成功率。而單細胞全基因組擴增（whole genome amplification，WGA）技術的選擇與評價，不同測序平臺的數據量要求，分析算法的選擇以及陰陽性預測的劃分標準等，這些均是影響胚胎植入前染色體非整倍體檢測結果的因素［6］。目前單細胞全基因組擴增包括多重置換擴增（multiple displacement amplifica?tion，MDA）、多次退火環狀循環擴增（multiple annealing and looping?based amplification cycles，MALBAC）和簡并寡核苷酸引物PCR（Degenerate oligonucleotide primerPCR，DOP?PCR）等技術方法，每種方法各有自己的優勢［7?8］。為使胚胎植入前遺傳學篩查更加規范并能夠有效地實施，國內外發布不同的胚胎植入前遺傳學診斷和篩查技術的指南性文件和專家共識［9?10］。傳統的細胞遺傳學核型分析一直被用作診斷染色體異常的金標準，然而它費時費力且很大程度上依賴于細胞培養，染色體分辨率很低，為5～10 M。高分辨率染色體微陣列分析（CMA）技術可以檢測染色體數目異常、微缺失/重復、單親二體，在人力資源有限的產前診斷實驗室中，CMA 可以單獨用于代替細胞遺傳學核型分析。拷貝數變異測序（CNV?Seq）分辨率為0.2 Mb，用于檢測具有臨床意義的染色體異常［11］。2020年，美國醫學遺傳學和基因組學學會（ACMG）等發布對CNV 致病性評估的最新指南，對>100 kb 的CNV 進行分類，分為致病性CNV（patho?genic CNV，pCNV）、可能致病性CNV（1ikely patho?genic CNV，lpCNV）和良性CNV（benign CNV，bC?NV）等5 類［12］。CNV 是良性的或者是致病性的，取決于它們的位置和基因含量，致病性CNV 越來越多地與復雜疾病相關，尤其是一些結構性先天性異常［13］。參考臨床上致病性CNV 的異常片段大小和檢測方法的靈敏度，我們將染色體異常片段大小設置為4Mb，用于評價試劑盒CNV 檢測能力。胚胎嵌合是指在胚胎的組成細胞中存在兩種或以上不同染色體組成的細胞系，對于介于正常與異常之間的整倍體/非整倍體嵌合胚胎，需要設置嵌合報出的閾值［14］。對于嵌合胚胎的檢測，不同研究報道對于診斷染色體嵌合推薦的閾值，國際胚胎植入前遺傳學診斷協會（Preimplantation Genetic Diagnosis International Society，PGDIS）推薦的嵌合報出閾值是20%～80%［15?16］。

中國食品藥品檢定研究院研制了胚胎植入前染色體非整倍體國家參考品，用于試劑盒的注冊檢測和上市后監督抽驗工作。為了評價試劑盒對囊胚篩選中染色體不同大小CNV 的檢測能力，國家參考品設置了不同異常片段大小的國家陽性參考品，并規定異常片段大于4 Mb 的陽性參考品對應的染色體異常要求檢出率達到100%，異常片段小于等于4 Mb 的陽性參考品對應的染色體異常要求檢出率達到30%以上。研究結果顯示胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（半導體測序法）對異常片段大于4 Mb 的國家陽性參考品均能夠檢出對應的染色體異常，對異常片段小于等于4 Mb 的國家陽性參考品的檢出率為86.7%，符合要求。針對嵌合胚胎，國家參考品設置了30%嵌合的嵌合體樣本，要求其檢出率應達到30%以上，同時要求相對應的70%嵌合體樣本的檢出率應達到60%以上。研究結果顯示試劑盒對30%嵌合比例國家嵌合體參考品的檢出率為50%，對70%嵌合比例國家嵌合體參考品的檢出率為83.3%，符合相應的要求。對于國家陰性參考品，試劑盒均未檢出范圍內的染色體異常。本研究表明胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（半導體測序法）能夠符合國家參考品的陽性參考品符合率、陰性參考品符合率和嵌合體參考品符合率的要求，國家參考品能夠對胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒的質量進行有效評價，具有很好的適用性。