凝血因子與妊娠期高血壓疾病發生的相關性

李智 郝辰珺 李艷秋

在正常生理狀態下，機體凝血與抗凝血處于動態平衡，促進和抑制血液凝固的物質相互作用與制約構成了凝血過程的自我控制與調節［1］。當正常晚期妊娠時機體處于一種高凝狀態，這種高凝狀態有利于防止分娩時過多出血［2］。但這種高凝狀態，一旦有產科誘發因素存在很容易發展成妊娠期高血壓疾病［3］。而妊娠期高血壓疾病又是產科常見并發癥，成為產婦死亡的主要原因［4］。

隨著蛋白質組學的迅速發展，血液蛋白質組學成為了研究HDCP 病因、發病機制及相關標志物的一個重要組成部分［5］。機體的凝血因子與炎性因子作為蛋白質很容易通過蛋白質組學的檢測發現。

在本研究中，通過比對妊HDCP 與正常妊娠患者血清蛋白質組學分析，利用高通量蛋白質組學方法篩選出與HDCP 及凝血因子相關的蛋白質作為代表性的診斷標志物。

1 資料與方法

1.1 研究對象

血清樣本均來自廣州市番禺區婦幼保健院（何賢紀念醫院），在2020 至2021年間招募了妊娠期女性，所有納入該研究的研究者均在本院圍產醫學門診建卡并按期隨診，采集患者信息資料，如身高、體重、年齡、孕前體重指數BMI，孕期4～20 周的血壓情況。最終在所有受試者中各選取12 例年齡、BMI、孕周（孕4～20 周）相匹配的患者作為HDCP 組與健康對照組，取每組成員的血清作為研究樣本。納入標準：HDCP 組，符合中華醫學會婦產科學分會2020年公布的妊娠期高血壓疾病診治指南中HDCP 的診斷［6］：收縮壓（SBP）>140 mmHg，舒張壓（DBP）>90 mmHg。分為輕度（SBP 140～149 和DBP 90～99 mmHg），中度（SBP 150～159和DBP 100～109 mmHg）和重度（SBP≥160 和DBP≥110 mmHg）。滿足以下四種情況之一：①先前存在的高血壓；②妊娠高血壓和先兆子癇（PE）；③先前存在的高血壓加上疊加的妊娠高血壓伴蛋白尿④無法分類的高血壓［7］。經血壓監測確診，自然受孕且單胎妊娠，胎兒宮內發育正常。正常妊娠組：確診的無妊娠期高血壓疾病的孕周4～20 周的與疾病組匹配的同期孕婦。排除標準：經檢查無肝、腎、心血管、出血及血栓性疾病史，既往有高血壓病史、流產史、重要臟器疾病、精神異常、多胎妊娠的患者，且一個月內服用過任何影響凝血功能的藥物。研究獲得倫理委員會審批，所有受試者均簽署書面同意書。

1.2 樣本采集

HDCP 組12 例，來自婦產科住院病人；正常妊娠組12 例，來自門診產檢病人。各組人員均在早上采集空腹靜脈血5 mL，放入EDTA K2管中，在4℃條件下放置30 min，以1 000 g，4℃離心5 min，取分離血清成分轉移入1.5 mL 試管或離心管于-80℃冰箱凍存。

1.3 樣本處理

樣本進行蛋白質提取，蛋白定量，蛋白酶切后進行iTRAQ 試劑標記，后采用第一維高pH?RP 液相分離及第二維反相液質聯用RPLC?MS 檢測進行質譜檢測，分離后的肽段直接進入質譜儀Ther?mo Scientific Q Exactive 進行在線檢測。

1.4 統計學方法

實驗使用Proteome Discoverer 2.2（Thermo fisher）軟件進行數據庫檢索；采用SPSS 21.0 專業統計學軟件進行數據分析；計量資料以（）表示，進行t檢驗；計數資料以率n（%）表示，用χ2檢驗；P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 入組患者臨床資料統計

兩組受試者除血壓外，其他資料數據比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of clinical data（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of clinical data（±s）

特癥HDCP 組正常妊娠組t 值P 值n 12 12年齡（歲）26.37±3.03 25.28±2.83 0.911 0.372 BMI（kg/m2）26.86±3.5 25.59±3.90 0.840 0.410孕周（周）15.92±2.2 16.22±2.30 0.327 0.747收縮壓（mmHg）132.21±10.98 111.56±12.12 4.374<0.001舒張壓（mmHg）86.11±18.82 66.56±15.99 2.742 0.012

2.2 樣本定量結果

本試驗采用Bradford 定量法和SDS?PAGE 對樣品進行質量檢測，各樣本，無高峰度蛋白、雜質污染和蛋白降解。

2.3 鑒定與定量結果評估

對鑒定到的多肽長度進行分析顯示，本次蛋白質組檢測中，大部分的多肽長度分布在6～20 個氨基酸之間。說明蛋白組檢測前期樣本處理符合要求。見圖1。

圖1 質譜檢測多肽長度分布范圍圖Figure 1 Mass spectrometry detection of peptide length distribution range

通過對原始數據分析顯示，本次試驗中有68個蛋白是通過單一的多肽進行鑒定（占鑒定到的總蛋白的比例為：68/514=13.2%），超過86.8%的蛋白是通過兩條以上的多肽同時進行鑒定和半定量分析，數據質量符合蛋白組檢測要求。見圖2。

圖2 蛋白鑒定采用多肽數量分布圖Figure 2 Protein identification using peptide quantity distribution map

通過對差異蛋白的分布進行分析，顯示大部分蛋白分布于中心無差異區域，只有少量的蛋白分布于具有顯著差異的兩端（上調和下調）區域，見圖3。

圖3 質譜檢測蛋白差異分布圖Figure 3 Mass spectrometry detection protein difference distribution map

2.4 差異指標篩選

采用變異倍數分析（Fold Change Analysis，FC Analysis）、ANOVA 檢驗對蛋白質進行單變量統計分析，并繪制火山圖（Volcano Plot）。同時篩選變化倍數（fold change）大于或小于1.2 倍以及顯著性分析p value<0.05 的指標。見圖4。

圖4 質譜檢測火山圖Figure 4 Mass spectrometry detection volcano map

經過分析得到140 種差異顯著的蛋白質，經篩選，140 種差異顯著的蛋白質中有4 種是與抗凝凝血因子相關，分別是抗凝血酶?Ⅲ（antithrombin?Ⅲ）、凝固輔助因子Ⅸ（Coagulation factor IX）、F13A1 凝血因子A1 亞基前體（F13A1 coagulation factorA1 subunit precursor）、凝血因子Ⅹ（Coagulation fac?tor X）（P<0.05），FDR 為p 值的矯正系數。見圖5。

圖5 凝血相關的差異蛋白質譜Figure 5 Coagulation?related differential protein profile

3 討論

HDCP 在我國的發病幾率達到9.4%，而國外的發病幾率高達7%～12%，已經嚴重影響了母嬰健康。這種妊娠期并發癥已被證實為引發不良妊娠結局的主要原因［7］。研究顯示，HDCP 的女性患胎膜早破，腦血管事件，器官衰竭和彌散性血管內凝血（disseminated intravascular coagulation DIC）的風險更高［8］。目前，有報道認為人體血液凝固平衡系統紊亂而導致血液呈現高凝狀態是誘發HDCP的獨立危險因素［8］。而也有研究顯示，血脂水平和炎性因子在的發病過程HDCP的發生、發展中扮演了重要的角色［9］。

HDCP 時全身小動脈痙攣性收縮，缺氧受損，內皮細胞腫脹、變性、缺血，而血流緩慢，血液粘度增加，血小板及纖維蛋白原可粘附基質上，使纖維蛋白原、血小板及其他凝血因子消耗。使其凝血酶原時間（PT）明顯增高，纖維蛋白原消耗性降低，凝血因子Ⅵ明顯消耗性下降，胎盤等分泌組織凝血活酶（TF）增多而組織因子途徑抑制物（TFPI）則消耗性下降，這種凝血狀態很易發生DIC，由于纖維栓子阻塞于微血管內，可引起內臟器官受損，如未能及時診斷和處理，可導致孕產婦死亡。故HDCP 發病過程與彌漫性血管內凝血的過程關系密切。DIC 的發生與多種凝血因子相關。本研究發現了與妊娠期高血壓相關的4 種凝血因子：抗凝血酶?Ⅲ、凝固輔助因子Ⅸ、F13A1 凝血因子1亞基前體、凝血因子Ⅹ，這四種凝血因子均參與凝血途徑與凝血機制并發揮作用。

肝素與ATⅢ所含的賴氨酸結合后引起ATⅢ構象改變，使ATⅢ所含的精氨酸殘基更易與凝血酶的絲氨酸殘基結合。研究表明，HDCP 的孕婦中AT 的水平顯著升高，處于慢性DIC 狀態，導致抗凝血酶Ⅲ的消耗增加和血漿濃度降低［10］。

凝固輔助因子Ⅸ被認為是在凝血過程中被激活之前作為惰性酶原在血液循環中。它抑制細胞遷移，增加對基質的粘附力并增強細胞間粘附力。相反，活化的凝血因子增強了細胞遷移，抑制對基質的粘附，并抑制了細胞間的粘附［11］。它作用于外源與內源途徑的十字路口，并作用于血管損傷部位的血小板促凝膜，HDCP 的發生可能導致凝血因子IX 增加，加速內源性凝血進程［12］。

凝血因子Ⅲ是外源性凝血途徑的起始因子，通過與凝血因子Ⅶ結合并使其激活，形成TF?FVⅡ/FVⅡa 復合物，同時激活凝血因子IX、X 而啟動血液凝固級聯反應。凝血因子X 通過內在的Xase 復合物激活，由IXA 因子結合到膜上的VIA 因子，是放大凝血反應所必需的［14］。

妊娠期血液高凝狀態是一種常見現象，正常孕婦孕12 周時，Ⅱ、Ⅷ、Ⅹ因子和纖維蛋白原增高。抗凝血酶Ⅲ、蛋白C、蛋白S 和其他抗凝物因子的改變不平衡，蛋白S 下降40%～50%，抗凝血酶Ⅲ和蛋白C 仍保持穩定。纖溶酶原和尿激酶下降，高半胱氨酸（Hhcy）和Ⅺ因子增加。兩種或以上因素互相作用，有利于血液高凝狀態形成，而血液高凝狀態又是HDCP 的一種常見現象［15］。現在臨床主要面對的問題是，因未能及早識別妊娠期血液高凝狀態導致發現時已進展為重癥。因此，早期診斷尤為重要妊娠期血液高凝狀態。而臨床研究發現，它發生可能與凝血功能障礙有關。同時，妊娠期使用抗凝劑是一個重要的因素。妊娠與靜脈血栓栓塞風險增加五倍有關，在產褥期風險上升到二十倍或更多。如果存在潛在的血栓形成傾向，則風險會進一步增加。靜脈血栓栓塞的風險持續到產后將近12 周。HDCP 患者機體內血液普遍處于高凝狀態，其凝血功能往往發生異常改變，所以及時檢查凝血功能及凝血因子對妊娠期高血壓疾病診斷起著重要作用。