HPLC法測定參苓安神膠囊中橙皮苷含量

李 建 黃宇思 賴 慧 王 謙 米曉琴 趙福蘭 陳 立

參苓安神膠囊是根據西南醫科大學附屬中醫醫院一名老中醫多年臨床用藥經驗，以參苓白術散與棗仁安神顆粒基礎方加減變化而成，由酸棗仁、黨參、茯苓、陳皮、白術、甘草等藥物組成的復方制劑[1]，在臨床應用多年，療效確切，安全可靠。本方是治脾虛失眠的代表方。生理條件下,臟腑調和,氣血充足,心有所養,心血得靜,衛陽入于陰而寐[2]。“脾胃為后天之本”“氣血生化之源”，脾胃虛弱，納運乏力，故飲食不化；水谷不化，清濁不分，癥見腸鳴泄瀉，濕滯中焦，氣機被阻，而見胸脘痞悶；脾失健運，氣血生化不足，則心神失養，出現心悸、失眠和健忘，此癥為典型的子病(脾虛)及母(心悸、失眠)，治宜補益脾胃，使心腦有所濡養，而心悸、失眠之證自解[3]。在前期的研究中已將方中酸棗仁、黨參、白術、陳皮進行了薄層定性鑒別[4]。為進一步控制制劑，應用HPLC對制劑中所含的有效成分橙皮苷進行了含量測定。

1 儀器與試藥

SSI(美國科學系統公司)液相色譜，浙大N3000色譜工作站；JL-180DTH超聲波清洗器；sartoriusBP211D型電子天平(感量0.1 mg；0.01 mg，載量210 g；80 g)，橙皮苷對照品(721-201211)購自中國藥品生物制品檢定所，參苓安神膠囊三批(202007012，202007025，202007034);所用甲醇為色譜純，水為醫院制劑室自制重蒸餾水，試驗所用其他試劑均為分析純，不再一一列出。參苓安神膠囊及陳皮的陰性對照樣品由醫院制劑室自制。

2 方法

2.1 指標性成分選擇參苓安神膠囊由酸棗仁、黨參、茯苓、陳皮、白術等組成，可選指標成分較多，結合現有文獻資料研究[5]，酸棗仁為方中君藥之一，但其主要成分酸棗仁皂苷A、B及斯皮諾素在國內復方制劑中測定含量的很少，且本方中酸棗仁的用量不大，測定其含量難度較大，故選性質比較穩定含量較高的橙皮苷為指標性成分進行含量控制。

2.2 檢測波長的選擇對橙皮苷對照品溶液進行紫外掃描(200～700 nm)，由紫外圖譜可見橙皮苷在283 nm波長處峰最高，是最大吸收，故實驗選擇283 nm 作為本次實驗橙皮苷含量測定的檢測波長。

2.3 橙皮苷對照品溶液的制備精密稱定橙皮苷對照品6.28 mg于50 ml容量瓶中，制成0.1256 mg/ml的溶液作為母液，稀釋2倍即得。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 提取溶劑的考察取參苓安神膠囊內容物共9份，每份1 g，精密稱定，置平底燒瓶中,精密加甲醇、乙醇及水80 ml，每種溶劑各3份，加熱回流30 min，取出放冷，濾過，濾液置100 ml容量瓶中，用少量相應溶媒分次洗滌，洗液濾入同一容量瓶中，再加相應溶媒至刻度，搖勻，取定容后的溶液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得供試品。按本實驗色譜條件進行測定。見表1。

表1 提取溶劑的考察結果

由表1可見，3種提取溶劑中以甲醇作為溶媒，橙皮苷的含量最高，乙醇次之，水最低，故實驗以甲醇作為提取溶劑。

2.4.2 提取方法的考察實驗用超聲處理和加熱回流進行了對比試驗。取參苓安神膠囊內容物共6份，每份1 g，精密稱定，置平底燒瓶中,精密加甲醇80 ml，加熱回流30 min和超聲提取30 min，取出放冷以后，用濾紙濾過，濾液置洗凈干燥好的100 ml容量瓶中，用少量甲醇分多次洗滌[6]，洗液濾并入同一容量瓶中，再加甲醇至刻度，搖勻，取定容后的溶液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。按本實驗色譜條件進行測定，加熱回流所得橙皮苷的含量明顯高于超聲處理結果，故本實驗選用加熱回流作為橙皮苷提取方法。見表2。

表2 提取方法的考察

2.4.3 提取時間的考察取參苓安神膠囊內容物共3份，每份1 g，按供試品制備方法分別提取15、30、45 min。按色譜條件測定，計算含量，加熱回流30 min所得橙皮苷含量最高，所以本實驗選擇橙皮苷的提取時間為30 min。

綜上所述，本實驗供試品溶液制備方法如下：取參苓安神膠囊內容物1 g,精密稱定，置平底燒瓶中,精密加甲醇80 ml，加熱回流30 min，取出放冷以后，用濾紙濾過，濾液置洗凈干燥好的100 ml容量瓶中，用少量甲醇分多次洗滌，洗液濾過后并入同一容量瓶中，再加甲醇至刻度，搖勻，取定容后的溶液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。見表3。

表3 提取時間考察結果

2.5 缺橙皮陰性溶液的制備按供試品制備方法同法制得。

2.6 色譜條件的選擇流動相的選擇實驗曾參考陳皮藥材的含量測定，選用①甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)；②甲醇：0.05 mol/l磷酸：水(32∶3∶65)；③甲醇-冰醋酸-水(30∶4∶66)[7]；④乙腈-0.15%的醋酸溶液(17∶83)為流動相進行橙皮苷的含量測定比較，流速按1.0 ml/min進行，柱溫35 ℃，以AichromBond-AQ C18(250×4.6 mm，5 μm)柱為分析柱進行實驗研究，結果①甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61為流動相，橙皮苷達到基線分離明顯，峰形對稱；陰性對照無干擾。故流動相選擇甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)，流速1.0 ml/min，柱溫35 ℃。

分析柱的選擇 實驗曾用AichromBond-AQ C18(250×4.6 mm，5 μm)、Kromtek C18(250×4.6 mm，5 μm)柱[8]，以甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)為流動相，2根柱子均能達到滿意的分離效果，橙皮苷峰與相鄰峰分離度都大于1.5，理論塔板數也大于2000。故方法學研究實驗選用AichromBond-AQ C18(250×4.6 mm，5 μm)色譜柱。

2.7 標準曲線與線性范圍精密稱定橙皮苷對照品適量，加甲醇制成不同濃度的對照品溶液，搖勻，作為對照品溶液(0.0628 mg/ml)，分別精密進樣1 μl、3 μl、5 μl、7 μl、9 μl、11 μl、13 μl、15 μl，按色譜條件進行分析，測定峰面積，橙皮苷進樣量在0.0628～-0.942 μg 范圍內與峰面積呈良好的線性關系，得出回歸方程及相關系數：Y=1E+06X+16645，R2=0.998(Y為峰面積，X為橙皮苷進樣量，單位為μg)；最后以進樣量(μg)為橫坐標(X)，峰面積(A)為縱坐標(Y)繪制出標準曲線。

3 結果

3.1 精密度試驗精密吸取對照品溶液(0.0628 mg/ml)及供試品溶液各10 μl，分別注入同一液相色譜儀，按實驗所得出條件進行分析，分別測定5次，計算峰面積，對照品峰面積平均值為836741，RSD為0.65%；供試品峰面積平均值為535110，RSD為0.18%，實驗結果表面該儀器精密度良好。

3.2 穩定性試驗按前文對照品與供試品制備方法分別制得橙皮苷與對供試品溶液，放置于室溫下，分別在不同的時間段進行含量測定，記錄色譜圖及結果，用以考察對照品與供試品溶液的穩定性，供試品及對照品溶液在配置后24 h內測定，結果穩定。見表4。

表4 穩定性實驗結果

3.3 樣品重現性試驗稱定參苓安神膠囊1 g，共5份，按樣品制備方法和測定方法進行測定，參苓安神膠囊供試品含量平均值為2.38%，RSD=0.36%，表明該實驗重現性良好，測定結果較為穩定。

3.4 加樣回收率試驗精密稱取參苓安神膠囊適量，6份，分別加入對照品，按供試品測定方法進行測定，按加樣回收率計算方法進行計算，測得平均回收率為99.4%，RSD=0.27%，表明回收率好。

3.5 樣品測定按參苓安神膠囊含量測定方法對參苓安神膠囊3個批次的樣品進行含量測定，HPLC圖譜見圖1。3個批次產品每粒含橙皮苷為1.20～1.30 mg，平均為1.26 mg，考慮到參苓安神膠囊含量結果與原藥材批次有較大關系，影響藥材含量的因素也較多，而且裝量差異也對測定結果由影響，根據大生產實際要求，以平均含量下浮20%計算，暫定參苓安神膠囊每粒含橙皮苷含量不少于1 mg，待以后在研究中積累數據做進一步調整。見表5。

注：對照品(A)、供試品(B)陰性對照(C)。圖1 橙皮苷對照品與供試品HPLC色譜圖

表5 供試品中橙皮苷含量測定結果

4 討論

方中的君藥為黨參、茯苓和白術，黨參的主要有效成分多糖、苷類和甾醇類，用水煎煮提取，符合傳統用藥習慣，提取效果較好，在前期的研究中已經對黨參進行了定性鑒別，故未對黨參進行含量測定[9]；茯苓的主要成分為茯苓聚糖、茯苓酸、脂肪酸及無機物等，根據文獻資料的查詢，暫未找到可行的方法對茯苓有效成分進行測定；而方中白術進行了揮發油的提取，也對白術進行了定性鑒別，所以未對白術的定量鑒別進行進一步的研究。

試驗中曾考慮將酸棗仁皂苷A、B作為質量控制指標，但由于文獻資料太少，且酸棗仁用量較少，沒有取得很好的效果，并且酸棗仁在前期的研究中已經做了定性研究，而本方是醫院院內制劑，考慮生產成本及實際生產需要，對方中的其他藥材沒有做進一步含量測定，待以后進一步研究中逐步完善質量標準。

實驗中甲醇提取和乙醇提取含量差異不大，也曾嘗試將乙醇作為提取溶劑，但乙醇提取成分較多，干擾峰較多，分離度也不好，也不易于揮干，揮干后也難于再次溶解定容， 2.4用HPLC測定參苓安神膠囊中橙皮苷的含量，可查文獻資料多，技術成熟，具有操作簡單、重現性好、測定數據可靠等優點,此方法可行性較高,可作為該制劑的質量控制。