圍封、放牧、刈割對內蒙古典型草原土壤線蟲群落的影響

侯林秀， 張 斌， 孫浩宇， 徐智超， 王永慧， 溫 璐， 王立新

(內蒙古大學生態與環境學院， 內蒙古 呼和浩特 010021)

線蟲作為陸地生態系統中數量最多、分布廣泛的土壤后生動物類群，在土壤有機質分解和養分循環方面起重要作用[1-2]。它們常被看作是指示土壤健康狀況、衡量生態系統抵抗力和恢復力的重要生物[3]，這主要歸因于土壤線蟲對環境變化更為敏感的反應能力、分離鑒定方法的易操作性、食性的多樣性以及與其他生物群落更為緊密的關聯性等[4]。這些特點決定它們可以通過自身代謝活動和取食活動等多種方式影響土壤有機質分解[5]。近年來，越來越多的學者針對土壤線蟲群落展開研究，集中于探討線蟲群落對不同生物因素(包括植被類型、微生物、其他小動物)[6-8]及非生物因素(氣候變化、土質和土層深度、土壤理化性質等)[9-12]的響應機制。

內蒙古典型草原是中國北方溫帶草原的主體，在碳氮循環、氣候調節等方面具有重要作用，同時也是當地居民賴以生存的基礎[13-14]。圍封、放牧和刈割作為典型草原最主要的草地利用方式，能改變草地生產力及土壤有機碳輸入的數量和質量等[15-16]，也會對土壤線蟲群落產生影響[17-18]。已有學者分析土壤線蟲群落對草地利用方式的響應情況，但基本上僅針對一種或兩種利用方式展開研究，未同時對比圍封、放牧、刈割對土壤線蟲的影響，且互相之間尚未形成一致的結論[19-21]。此外，大部分草地位于生態脆弱帶上，除區域性人為干擾所導致的環境變化對土壤線蟲群落產生顯著影響之外，線蟲群落對全球性氣候變化也十分敏感[22]。近年來，地表氣溫、CO2濃度、氮沉降量等有明顯的升高趨勢，并將持續性上升，降水格局也將發生改變[23-24]，在此影響下，土壤線蟲群落對草地利用方式的響應情況必將會產生新的變化，不同的研究時間和環境背景在很大程度上決定了前人研究結果不相同。

因此，探究當前氣候環境下不同草地利用方式對溫帶典型草原土壤線蟲群落組成的影響十分必要。通過揭示圍封、放牧和刈割處理下土壤線蟲種類、豐度、生態特征指數的變化規律，綜合評估不同利用方式下草地受干擾程度和生態系統可持續利用潛力，以期為全球環境變化大背景下實現高效合理的放牧管理提供生物學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于內蒙古自治區錫林浩特市毛登牧場內蒙古大學草地生態學實驗基地(44°10′ N，116°28′ E)，海拔1 102 m，屬典型溫帶半干旱大陸性氣候，年平均氣溫2.36℃，年平均無霜期約為150 d，年平均降水280 mm左右，且降雨多集中在6-9月，約占全年的80%。土壤類型以栗鈣土為主，土壤pH值平均為8.07，地上植物優勢種為羊草(Leymuschinensis)、克氏針茅(Stipakrylovii)等[25-26]，屬典型草原。

1.2 試驗設計

實驗平臺建立于2012年，選取地勢平坦、土壤類型相近的3個100 m×100 m樣區，樣區之間的間距為33 m，按照隨機區組設計在每個樣區設置3個大小相同的樣地(33 m×33 m)，間距約為1 m，分別對應圍封(F)、放牧(G)、刈割(C)3種利用方式。每年7-8月在放牧樣地連續放牧6只羊，持續到植物留茬高度為6 cm(該高度被認為是草地可持續利用的合理高度[27]，以研究區優勢種高度為準)；刈割處理在每年8月下旬進行，植物留茬高度為6 cm；圍封處理不實施人為干預。

1.3 樣品采集及數據測定

于2019年8月采用多點混合采樣法采集土樣，每個樣地沿對角線選取3個樣點，用直徑為8 cm的土鉆鉆取0～10 cm土壤3鉆，同一樣地的9鉆土壤混合為1個樣品，共計9個土樣，盡快帶回實驗室置于-80℃冰箱內冷凍。運用E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)對土壤樣品進行總DNA提取，DNA質量利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；采用引物nf1F-18sr2bR，即nf1F5′-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3′和18sr2bR5′-TA CAAAGGGCAGGGACGTAAT-3′進行PCR擴增[28]，正式試驗則通過TransGen AP221-02進行。委托上海美吉生物醫藥科技有限公司利用Illumina Miseq PE 3000平臺進行土壤線蟲測序，測序數據比對物種注釋數據庫為NCBI(NT)。

此外，在8月上旬的生物量峰值階段于每個樣地隨機選擇1 m×1 m的小樣方，記錄樣方內的植物物種數以表征植物物種豐富度。

1.4 土壤線蟲群落生態學指數計算

用Jaccard相似性指數(ISj)[29]表征線蟲群落相似性：

(1)

用豐富度指數(S)、Shannon指數(H′)、優勢度指數(λ)、均勻度指數(J′)來衡量土壤線蟲的物種多樣性，用以描述線蟲群落在局域生境內的類群數量和分布情況[30]。利用成熟度指數(Maturity index，MI)、植物寄生線蟲成熟度指數(Maturity index of plant parasite,PPI)、基礎指數(Basic index，BI)、結構指數(Structure index，SI)、富集指數(Enrichment index，EI)來表征線蟲群落結構復雜度和土壤養分富集等[31]。

(2)

(3)

(4)

式中，S為群落物種數目；Pi為物種i的相對重要值，即物種i的個體在全部個體中的比例。

(5)

(6)

式(5)中，vi為第i類自由生活線蟲的Colonizer-persister值(c-p值)，Pi為物種i的相對重要值，即物種i的個體在全部個體中的比例。

式(6)中，vi為第i類植物寄生線蟲的c-p值，Pi為物種i的相對重要值，即物種i的個體在全部個體中的比例。

BI=100×[b/(e+b+s)]

(7)

SI=100×[s/(b+s)]

(8)

EI=100×[e/(e+b)]

(9)

式中，b為線蟲基礎組分，包括c-p值為2的食細菌線蟲、食真菌線蟲；e為線蟲富集組分，包括c-p值為1的食細菌線蟲和c-p值為2的食真菌線蟲；s為線蟲結構組分，包括c-p值為3～5的食細菌線蟲、食真菌線蟲和雜食-捕食性線蟲。

1.5 數據處理

在上海美吉生物醫藥科技有限公司云平臺進行在線分析(https://cloud.majorbio.com/)，在線蟲屬水平上利用基于Abund-Jaccard算法的ANOSIM分析反映組間差異，并基于Bray-Curtis距離算法對不同樣地的土壤線蟲群落進行主坐標分析(Principal coordinate analysis，PCoA)分析。采用SPSS 22軟件對線蟲營養類群相對豐度和線蟲區系指數進行單因素方差分析，并對樣地地上植物豐富度與土壤線蟲豐富度指數進行線性回歸。冗余分析(Redundancy analysis，RDA)使用Canoco 5完成。此外，為分析土壤線蟲群落的代謝活動特征，表征生態系統受干擾程度，將線蟲結構指數和富集指數整合在同一個坐標系內劃分象限進行分析[1,7](圖1)。繪圖使用Origin 2019b軟件。

圖1 土壤線蟲群落結構指數、富集指數權重區系分析的意義解釋Fig.1 The significance of analysis of soil nematode fauna weight between SI and EI注：圖中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ為象限分區，具有指示意義。下同Note:In the figure,Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,and Ⅳ are quadrant zones with indicative significance. The same as below

2 結果與分析

2.1 土壤線蟲測序結果及群落組成

如表1所示，所有土壤樣品總計測得線蟲有效序列2 404 條，共歸為38 個操作分類單元(OTU)，分屬于3綱6 目16 科18 屬19 種。對比不同利用方式樣地，土壤線蟲在科、屬、種水平上均呈現圍封>放牧>刈割的規律。在考慮物種豐度影響的前提下，ANOSIM距離分布箱式圖結果表明，不同樣地處理之間存在顯著差異(ANOSIM=0.383，P=0.007)(圖2)。

表1 不同利用方式下草地土壤線蟲群落的測序結果統計Table 1 Statistics of soil nematode community sequencing results under different utilization modes

圖2 不同利用方式下草地土壤線蟲組內、組間樣本距離分布箱式圖Fig.2 Box plot of soil nematode sample distance distribution within and between groups under different utilization modes注：Between指的是樣地之間的差異，其他分別代表各自組內差異Note:Between refers to the differences Between sample sites,while the others respectively represent differences within their respective groups

將土壤樣本中相對豐度小于1%的線蟲歸為其他線蟲屬。基于線蟲屬水平，在圍封、放牧、刈割樣地中，未分類線蟲相對豐度更高，分別占各樣地土壤線蟲群落的30.99%，35.09%，38.60%(圖3)。除未分類線蟲外，8個線蟲屬為3個樣地所共有，分別是吻球屬(Hoplotylus)、Amblydorylaimus、牙咽屬(Dorylaimellus)、擬麗突屬(Acrobeloides)、針屬(Paratylenchus)、真頭葉屬(Eucephalobus)、絲尾墊刃屬(Filenchus)、輪屬(Criconemoides)。不同利用方式下溫帶典型草原土壤線蟲群落組成差異較大，圍封、放牧、刈割樣地中占土壤線蟲群落主導地位的線蟲屬分別是未分類的細齒科(unclassified_Leptonchidae)、吻球屬(Hoplotylus)、牙咽屬(Dorylaimellus)，在對應樣地的相對豐度分別為31.96%，28.82%和28.38%。

為消除各樣地之間未分類線蟲的影響，對能具體鑒定到屬或個別無法詳細到屬水平但能確定科水平的土壤線蟲重新計算其相對豐度，結果如表2所示。所有樣地共有線蟲17 屬，其中圍封樣地共檢測到線蟲13 屬，群落優勢類群(個體數量占10%以上的類群)為未分類的細齒科(unclassified_Leptonchidae)、針屬(Paratylenchus)和擬麗突屬(Acrobeloides)；放牧樣地共有線蟲12 屬，優勢類群為擬麗突屬(Acrobeloides)、吻球屬(Hoplotylus)、Amblydorylaimus；刈割樣地共有線蟲10 屬，Amblydorylaimus、牙咽屬(Dorylaimellus)、吻球屬(Hoplotylus)、擬麗突屬(Acrobeloides)為該樣地線蟲優勢屬。所有樣地中，土壤線蟲常見屬有輪屬(Criconemoides)、真頭葉屬(Eucephalobus)、絲尾墊刃屬(Filenchus)等，莖屬(Ditylenchus)、獨壁齒屬(Campydora)、筒咽屬(Cylindrolaimus)等為稀有屬(個體數量占總體數量1%以下的類群)。

圖3 屬水平上不同利用方式下草地線蟲群落相對豐度占比Fig.3 Proportion of nematode community relative abundance under different utilization modes on the genus level

表2 不同利用方式下草地土壤線蟲群落組成及營養類群、c-p值(不包括未分類線蟲)Table 2 Soil nematode community composition,functional group and c-p value under different utilization modes (excluding unclassified nematodes)

圖4 土壤理化性質與土壤線蟲群落的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis (RDA) of soil physical and chemical properties and soil nematode community注：Acrobelo代表擬麗突屬，Amblydor為Amblydorylaimus，Aprutids代表艾普魯斯屬，Criconem代表輪屬，Dorylaim代表牙咽屬，Eucephal代表真頭葉屬，Filenchs代表絲尾墊刃屬，Hoplotyl代表吻球屬，Paratyln代表針屬，Xiphinem代表劍屬，Unclassi為unclassified_Leptonchidae(未分類的細齒科)，Others代指除未分類線蟲以外，所有相對豐度小于1%的線蟲類群。TC為總碳，TN為全氮，TOC為總有機碳，和分別為銨態氮和硝態氮Note:Acrobelo is Acrobeloides,Amblydor is Amblydorylaimus,Aprutids is Aprutides,Criconem is Criconemoides,Dorylaim is Dorylaimellus,Eucephal is Eucephalobus,Filenchs is Filenchus,Hoplotyl is Hoplotylus,Paratyln is Paratylenchus,Xiphinem is Xiphinema,Unclassi is unclassified_Leptonchidae,Others refers to all nematode groups with relative abundance less than 1% except for unclassified nematodes

2.2 土壤線蟲組間差異分析

PCoA分析結果顯示P值為0.054 0，3種草地利用方式下的線蟲群落結構未呈現顯著性差異，2個主成分分別可以解釋37.13%和24.6%的群落結構變化。但圍封樣地與放牧、刈割樣地相比，其土壤線蟲結構組成有相對更為明顯的差異性(圖5)。

圖5 屬水平上不同利用方式下草地線蟲群落結構的PCoA分析Fig.5 PCoA analysis of nematode community structure under different utilization modes on the genus level

為進一步探討土壤線蟲在種水平上的組間差異性，計算不同樣地之間的土壤線蟲相似性指數，可得出放牧和刈割樣地的相似性指數最高，為0.67；其次是放牧和圍封，為0.59；圍封和刈割樣地的土壤線蟲群落組成相似性指數最低，為0.53(表3)。

表3 不同利用方式下草地土壤線蟲群落組成Jaccard相似性指數Table 3 Jaccard index of soil nematode community composition between different utilization modes

2.3 土壤線蟲營養結構

線蟲的營養類型和c-p值如表2所示，所有樣地中共測得植物寄生線蟲6屬、食細菌線蟲4屬、食真菌線蟲4屬、雜食-捕食性線蟲3屬。3種利用方式下的屬于植物寄生線蟲的屬均多于同一樣地其他線蟲類群，具體為圍封5屬、放牧5屬、刈割4屬；食細菌線蟲屬數表現為圍封>放牧>刈割；與其他樣地相比，放牧條件下食真菌線蟲屬最多，但其相對豐度在三個樣地均低于1%；在放牧樣地中雜食-捕食性線蟲所包含屬數最少，僅有Amblydorylaimus一種，同時該屬線蟲在圍封和刈割樣地雜食-捕食性線蟲中占比分別為52.08%和99.71%，是整個研究區雜食-捕食性線蟲的重要組成部分。

植物寄生線蟲在放牧和刈割樣地中占據主導地位，其相對豐度分別為57.75%和67.41%，而在圍封處理下其相對豐度僅為29.89%(圖6)。此外，圍封樣地中食真菌線蟲的相對豐度顯著高于其余兩個樣地(P<0.01)，達47.15%。與其他線蟲類群相比，雜食-捕食性線蟲豐度在圍封處理下最小，為6.87%，但在放牧和刈割樣地中其豐度可達15%以上。食細菌線蟲在3種不同處理方式下的相對豐度差異不顯著。從線蟲營養類群組成看，放牧和刈割樣地之間不存在顯著差異。

圖6 不同利用方式下各營養類群線蟲群落相對豐度占比(不包括未分類線蟲)Fig.6 Relative abundance ratios of nematodes in different trophic groups under different utilization modes (excluding unclassified nematodes)注：同一線蟲營養類群數據中a,b表示在0.05水平上樣地間存在顯著差異性，A,B表示在0.01水平上樣地間存在顯著差異性Note:In the data of the same functional group of nematode,a and b indicated that there were significant differences among the sample plots at the 0.05 level,A and B indicated that there were significant differences among the sample plots at the 0.01 level

2.4 土壤線蟲區系分析

基于OTU水平計算不同草地利用方式下線蟲物種多樣性指數和線蟲功能團指數(表4)。不同利用方式對草地土壤線蟲群落豐富度指數影響不顯著，但顯著影響線蟲群落的Shannon指數、優勢度指數和均勻度指數(P<0.05)。各處理間Shannon指數和均勻度指數均表現為圍封和放牧樣地顯著高于刈割樣地(P<0.05)，而刈割樣地土壤線蟲的優勢度指數顯著高于圍封和放牧樣地(P<0.05)。雖然土壤線蟲豐富度指數大小對利用方式的響應不顯著，但研究區地上植物豐富度與土壤線蟲豐富度指數的線性回歸結果表明在P<0.05水平上二者之間呈現顯著線性關系(圖7)。

表4 不同利用方式下土壤線蟲群落物種多樣性指數Table 4 Statistics of soil nematode community species diversity index under different utilization modes

圖7 研究區土壤線蟲豐富度指數與地上植物豐富度的線性回歸分析Fig.7 Linear regression analysis of soil nematode abundance index and above-ground plant abundance in the study area

受利用方式的影響，放牧樣地的成熟度指數顯著低于刈割和圍封樣地(P<0.05)，而圍封樣地植物寄生線蟲成熟度指數顯著低于放牧和刈割樣地(P<0.05)(表5)。放牧樣地的基礎指數顯著高于刈割樣地(P<0.05)，而圍封樣地顯著低于刈割樣地(P<0.05)。結構指數整體變化規律性與基礎指數相反，為圍封>刈割>放牧，且圍封與其他處理間差異顯著(P<0.05)。刈割處理下的線蟲富集指數顯著高于其他利用方式(P<0.05)。土壤線蟲結構指數、富集指數權重區系分析結果顯示圍封樣地落于Ⅲ象限，未受到明顯的外界干擾，食物網穩定；而放牧和刈割樣地落于Ⅳ象限，C∶N高，受到環境脅迫，食物網呈現一定的退化特征(圖8)。

表5 不同利用方式下土壤線蟲功能團指數對比Table 5 Comparison of soil nematode functional group index under different utilization modes

圖8 不同利用方式下土壤線蟲群落結構指數、富集指數權重區系分析Fig.8 Analysis of soil nematode fauna weight between SI and EI under different utilization modes注：圖中橫線表示結構指數的標準差，豎線表示富集指數的標準差Note:In the figure,the horizontal line represents the standard deviation of the structure index,the vertical line represents the standard deviation of the enrichment index

3 討論

3.1 不同利用方式對土壤線蟲群落特征的影響

在屬水平上，除未分類的土壤線蟲以外，圍封、放牧、刈割樣地中線蟲優勢類群均不相同，說明草地利用方式在一定程度上改變了線蟲群落結構組成。而基于Abund-Jaccard算法的ANOSIM分析與基于Bray-Curtis距離算法的PCoA分析結果表明利用方式對土壤線蟲群落結構的影響主要是由于線蟲豐度差異造成，而非類群差異。例如放牧顯著增加了吻球屬(Hoplotylus)的相對豐度，而刈割使得牙咽屬(Dorylaimellus)豐度顯著增大。

同時，群落生物組成結構可以通過物種多樣性來量化，用以反映群落內物種的多少以及各生境之間的相似性和差異性[33]。與其他2種處理方式相比，刈割對溫帶典型草原土壤線蟲群落Shannon指數、優勢度指數和均勻度指數均影響顯著(P<0.05)。與圍封樣地相比，刈割處理對線蟲多樣性指數的影響大于放牧處理，出現這一現象的原因，可能與放牧環境下羊在進行選擇性取食的同時留下糞便等有機物促進土壤養分循環有關。研究表明不同草地利用方式會對土壤線蟲群落結構產生影響，并形成組間差異。這可能是因為草地土壤養分狀況會隨著人為干擾而發生變化[34]，同時土壤動物的生存受到土壤環境和營養狀況制約[35]。土壤線蟲群落與土壤理化性質的冗余分析結果對這一結論起到一定支撐作用，有機碳含量顯著影響了線蟲群落結構。

線蟲群落特征在受到土壤因素影響的同時，與地上植物也存在緊密相關關系。植物群落的物種多樣性及其特性會對土壤線蟲群落產生影響[36-37]，土壤線蟲也會對植物生長產生反饋作用間接影響植物生產力發生變化[38-39]。一方面，研究表明地上植物豐富度指數與土壤線蟲豐富度指數相關性顯著(P<0.05)；另一方面，該研究區的地上植物總量為：放牧>刈割>圍封[40]，這與本研究土壤線蟲豐富度指數大小的結果一致。與物種多樣性指數結果不同的是，在不考慮線蟲類群相對豐度大小而只考慮線蟲物種重疊度(即是否存在)的情況下，放牧與刈割樣地的線蟲群落組成相似度更高，說明與圍封相比，由于地上生物量的減少，牛羊啃食和刈割使得土壤線蟲在草地生態系統中所處的環境背景更為接近，進而導致二者的線蟲群落結構更為類似，即植物生長狀況會對土壤線蟲產生一定影響。

3.2 土壤線蟲對生態系統的指示功能

線蟲作為土壤生態系統的重要指示生物之一，其相關指標能較為準確地反映土壤狀況。線蟲群落中各營養類群所占比例大小可以用來指示生態系統健康程度的變化[41]。有研究表明植物在人為干擾下更易被植物寄生類動物所侵害[42]，本研究結果顯示刈割和放牧樣地中植物寄生線蟲的相對豐度均顯著高于圍封樣地(P<0.05)，該結果在一定程度上支撐了前人的研究結論。Wasilewska[43]曾提出，當其他生態系統向牧場生態系統轉變時，食細菌線蟲數量增多，而食真菌線蟲豐度有所降低。本研究結果與該結果基本一致，即與其他樣地相比，放牧樣地中食細菌線蟲相對豐度最高而食真菌線蟲相對豐度最低。在放牧活動干擾下，牛羊啃食和糞便堆積為細菌生長繁殖提供更為有利的環境條件，細菌所參與的降解途徑更為活躍[44]，這可能是食細菌線蟲數量增多的主要原因。雜食-捕食性線蟲是土壤微食物網中營養級別較高的參與組成部分，也是決定其復雜程度的關鍵生物類群[45]，放牧和刈割處理下的雜食-捕食性線蟲相對豐度顯著高于圍封對照組(P<0.05)，表明適當的外部干擾會使得土壤線蟲群落結構組成趨于復雜，放牧處理下相對更高的線蟲物種多樣性也在另一層面反映了這一規律。

除線蟲營養類群外，不同的草場利用方式也顯著改變了土壤線蟲功能團指數，并對后續草場管理實踐有指示作用。研究表明圍封樣地的土壤線蟲群落結構化程度高，連通性強；而其余兩種草地利用方式下的線蟲群落在外界干擾下呈現一定的退化特征，其中放牧條件下生態系統干擾退化程度更強，土壤線蟲群落對外部環境干擾的相對抵抗力有增大的趨勢。這些均與烏尼爾等[19]對典型草原0～10 cm土壤線蟲的研究結果相一致，在一定程度反映草地生態系統在外界干擾下的自我調節能力可以作用于土壤線蟲群落，并通過土壤線蟲的指示作用傳達出來。此外，刈割樣地的富集指數顯著高于其他處理(P<0.05)，表明刈割處理對土壤的養分富集有促進作用，其可能原因是與輕度放牧或不放牧利用相比，合理有序的刈割更有利于植被更新，增加土壤碳庫含量[46]。圍封、放牧和刈割作為常見的草場管理手段，在后續實踐中應得到合理利用，既要合理控制放牧強度，以免加快草場退化進程，同時也要進行間歇性圍封和刈割處理，分別以增強土壤微食物網的連通性和促進土壤養分循環和富集。

4 結論

圍封、放牧和刈割改變了土壤線蟲群落的類群數量、結構組成和生態指數。基于線蟲屬水平，線蟲群落受到土壤有機碳含量的顯著影響；按營養類群分類，圍封樣地的線蟲群落結構與其它兩個樣地差異顯著。圍封和刈割樣地的線蟲群落組成相似性指數最低，在圍封環境下，線蟲連通性和捕食關系有所加強，線蟲群落結構化程度高；刈割則顯著降低了線蟲Shannon指數和均勻度指數，而且有利于土壤養分富集。線蟲豐富度與地上植物豐富度呈顯著正相關關系，草地利用方式的改變或許會通過植物生長狀況間接影響土壤線蟲。