扇穗茅不同居群染色體數目及核型分析

楊 萍， 蘇 旭,3， 劉玉萍*， 王亞男， 胡夏宇， 陳金元

(1.青海師范大學生命科學學院， 青海 西寧 810008； 2.青海師范大學青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海 西寧 810008； 3.高原科學與可持續發展研究院， 青海 西寧 810016)

扇穗茅(Littledalearacemosa)是禾本科(Poaceae)雀麥族(Bromeae)扇穗茅屬(Littledalea)的一種高原特有疏叢短根莖禾草，主要分布于青藏高原及其毗鄰高山地區，僅有少部分居群處于鄰近的稍低海拔地區[1]。扇穗茅通常生長于高山草坡、河谷邊沙灘、灌叢草甸等極端環境下，是高山草甸的伴生種，具有較強的耐旱、耐寒、耐堿、耐貧瘠及抗病和抗風沙能力[2]；同時，該物種具有相對發達的根系，是保土固沙的一種重要植物；營養價值較高，也是畜牧業上的優良牧草[3]。目前，國內外學者已對扇穗茅的形態特征、地理分布、分類修訂、葉綠體基因組特點及種質資源等進行了研究[3-6]。譬如，周勇輝等[6]采用廣義形態性狀將藏扇穗茅歸并到扇穗茅中，作為異名處理；劉玉萍等[3]通過Illumina MiSeq高通量測序技術，探討了扇穗茅的葉綠體基因組特點及系統進化關系，建立了雀麥族物種的標準測序流程，認為其與小麥族(Triticeae)物種親緣關系較近。然而，目前從居群水平上對扇穗茅染色體的形態特征、核型參數及進化關系的研究未見報道。

染色體是細胞遺傳物質的載體[7]，其形態、數目和結構往往受外界影響較小[8]，在植物生長發育和繁殖過程中具有較高的穩定性。因此，通過對植物細胞染色體形態、數目、特征及核型參數的綜合分析，能夠有效探討不同物種或品種間的細胞學差異，從而闡明它們的起源和進化關系，為今后植物物種界定、遺傳育種和新品種選育提供細胞學佐證[9]。迄今為止，許多學者采用植物染色體常規壓片技術對多種禾本科植物染色體核型的研究揭示了它們的相對進化程度及系統發育關系。譬如，張同林等[10]通過對小麥族披堿草屬(Elymus)、鵝觀草屬(Roegneria)和賴草屬(Leymus)共5個類群的核型分析，認為賴草屬進化程度最低、鵝觀草屬最高、披堿草屬介于兩者之間；楊慧芳[11]利用火焰干燥法對冰草(Agropyroncristatum)不同居群進行了染色體制片并對核型作了分析，結果發現冰草的中亞、東亞與青藏高原居群間以及歐洲與中亞居群間親緣較近，中亞居群起源較早且進化較原始、歐洲居群起源相對較晚且進化程度較高，認為中亞是冰草的起源中心，染色體結構和數目變異是對新環境的適應；王亞男等[12]通過對沙鞭(Psammochloavillosa)6個不同居群染色體形態和核型的研究，發現沙鞭染色體數目恒定，有正中部著絲粒(Median point chromosome，M)、中部著絲粒(Median region chromosome，m)、近中部著絲粒(Submedian region cheomosome，sm)或近端部著絲粒(Subterminal region chromosome，st)4種類型，并推導了不同居群間的系統進化關系。據此，本研究采用染色體常規壓片技術，對扇穗茅6個自然地理居群的染色體數目、形態、核型參數等進行系統分析；在此基礎上，探討不同居群間的核型差異和親緣關系，為扇穗茅系統進化和優良種質資源篩選提供細胞學佐證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選取扇穗茅6個自然地理居群的成熟種子為試驗材料，具體采樣信息詳見表1。憑證標本保存于中國科學院西北高原生物研究所青藏高原生物標本館(QTPMB)。

表1 試驗材料及來源Table 1 Experimental materials and sources

1.2 試驗方法

1.2.1種子萌發 從扇穗茅6個代表居群中挑選飽滿成熟的種子，且每個居群中選取10粒種子進行萌發。首先將種子在—20℃冰箱中處理24 h，然后將其均勻放置于鋪有蒸餾水濕潤兩層濾紙的培養皿中[13]，隨后置于22℃恒溫培養箱中培養，當種子根長為0.5～1 cm時取樣預處理。

1.2.2預處理 預先將2.0 mL離心管用蒸餾水噴濕，保持管內外濕潤；然后，將剪下的扇穗茅根尖放于其中，立即將盛有根尖的離心管置于充滿N2O的密封罐中處理130 min，壓強設置為0.75 MPa。

1.2.3固定與解離 從密封罐取出離心管，預處理的根尖迅速放入含卡諾氏固定液(95%酒精∶冰醋酸=3∶1，現配現用)的離心管中，使根尖充分浸入固定液，隨后將離心管置于4℃冰箱中固定10 min以上，最后用45%乙酸解離5 min待用。

1.2.4制片、染色和觀察 解離好的根尖輕輕取出并放置于載玻片中央，用刀片切除多余部分僅保留根尖頂端分生組織，滴一滴改良的石炭酸品紅溶液，染色7～8 min后蓋上蓋玻片，用鑷子尖端輕輕敲擊使其充分均勻分散，迅速將載玻片放置于酒精燈上輕輕灼燒，待組織區域的液體蒸干后，用濾紙垂直向下按壓載玻片，保持細胞均勻分散，利用顯微鏡(Olympus BX53)觀察染色體的形態和數目，選取分散良好、形態清晰的染色體拍照[14]。

1.2.5數據分析 從扇穗茅每個居群中，選取10個分散良好、形態清晰、數目完整的染色體中期分裂圖拍照，同時進行染色體形態觀察、數目統計及數據測量與分析。即采用Adobe Photoshop 2020軟件測量所有居群的染色體長臂與短臂長度[15]，將數據導入Excel軟件中統計分析；依據李懋學[16]方法計算染色體總長度、臂比(Arm ratio，AR)、相對長度(Relative length，RL)；基于這些數據進行每個細胞同源染色體配對，統計同源染色體長臂和短臂平均值及總長度等參數，主要包括平均臂比(Mean arm ratio，MAR)、染色體長度比(Chromosome length ratio，CLR)、核不對稱系數(Karyotype asymmetry coefficient，As.K%)及臂比大于2∶1的染色體百分比(Chromosome proportion of arm ratio excess to 2)等，其中臂比大于2∶1的染色體百分比=臂比大于2的同源染色體數目/同源染色體組總數;核不對稱系數=(染色體長臂總長/全組染色體總長)×100%；然后，根據同源染色體核型參數，按照相對長度從大到小排序、著絲點排列在同一直線上、短臂在上、長臂在下，利用Excel和Photoshop軟件繪制染色體核型圖。此外，本研究涉及的相對長度系數(Relative length coefficient，I.R.L)依據Kuo等[17]方法、核不對稱系數根據Arano[18]方法及核型分類依照Stebbins[19]方法進行計算、統計和分析。

另外，參照邢世巖等[20]方法進行核型進化趨勢分析，利用Microsoft Excel 2010軟件繪制扇穗茅核型不對稱性程度散點圖，即核型二維進化圖；同時，聚類分析依據李曉莉等[21]方法，采用SPSS 26軟件統計分析染色體臂比平均值與方差、相對長度方差、染色體長度比和正中部著絲粒(M)、中部著絲粒(m)、近中部著絲粒(sm)或近端部著絲粒(st)染色體比例等，進行扇穗茅不同居群的染色體聚類分析。

2 結果與分析

2.1 染色體數目與倍性鑒定

通過對扇穗茅中期分裂相的觀察和測量，發現扇穗茅染色體均為二倍體，數目較為穩定，為2n=2x=28，不存在染色體數目和形態異常現象(圖1)。

圖1 扇穗茅有絲分裂中期染色體Fig.1 Mitotic chromosomes in metaphase of L. racemosa注：A，P119；B，P120；C，P067，D；P83；E，P84；F，P94。下同Note:A:P119；B，P120；C，P067；D，P83；E，P84；F，P94. The same as below

2.2 不同居群染色體形態特征與類型分析

從扇穗茅每個參試居群中，各選取10個分散良好、數目清晰、形態完整的染色體中期分裂圖，依據每條染色體位置和參數進行同源染色體配對，共獲得14對染色體，參數統計分析結果如表2所示。

表2 扇穗茅不同居群染色體參數Table 2 Chromosome parameters of different populations in L. racemosa

續表2

由表2可知，扇穗茅居群119和居群84的染色體為中部著絲點(m)和近中部著絲點(sm)染色體，居群120，67，83和94的染色體均為中部著絲點染色體，并且中部著絲點染色體占比較高；同時，依據染色體相對長度系數和Kuo分類標準，扇穗茅不同居群的染色體可以被劃分為短染色體S型(<0.76)、中短染色體M1型(0.76～1.00)、中長染色體M2型(1.01～1.25)和長染色體L型(≥1.26)四種類型(表2)。

2.3 不同居群染色體核型分析

通過對扇穗茅不同居群中期分裂相染色體的統計分析，本研究獲得了染色體長度比、臂比大于2的比率、核型公式與類型、核不對稱系數等參數(表3)；同時，根據各居群同源染色體參數繪制了核型模式圖(圖2)。

表3 扇穗茅不同居群的核型比較Table 3 Karyotype comparison of different populations in L.racemosa

圖2 扇穗茅不同居群的染色體核型模式圖Fig.2 Chromosome idiograms of different populations in L. racemosa

由表3可知，扇穗茅6個居群的染色體核型類型有2A，1B和2B三種，其中居群120的染色體核型類型是2A型，居群67是1B型，其余4個居群是2B型；就扇穗茅染色體臂比而言，居群83的臂比范圍為1.32～1.55(圖2D)，平均臂比最大(1.44)，居群67和84的臂比范圍分別為1.25～1.28(圖2C)和1.19～1.35(圖2E)，平均臂比最小(1.27)，其余3個居群的平均臂比介于兩者之間(表3)；同樣，扇穗茅居群67的染色體核不對稱系數最小，為55.67，而居群83的核不對稱系數最大，為57.88，表明扇穗茅不同參試居群的染色體核型差異較大。

2.4 不同居群染色體核型進化趨勢分析

以扇穗茅染色體的平均臂比為橫坐標，以長度比和核不對稱系數為縱坐標，分別繪制二維進化趨勢圖(圖3)。結果表明，扇穗茅的染色體核型呈“雙向進化趨勢”，如居群83的染色體沿平均臂比方向進化較快，居群119的染色體則沿長度比方向進化較快(圖3A)；然而，就染色體總體進化趨勢而言，居群83的進化程度較高，居群67的進化程度較低(圖3A)。同時，通過對扇穗茅染色體平均臂比和核不對稱系數的分析，我們發現扇穗茅染色體的總體進化趨勢沿二維圖右上角方向進化，即右上方的居群往往具有較高的進化程度，而左下方的居群進化程度相對較低。其中，居群83的平均臂比與核不對稱系數最大，位于二維圖右上方，進化程度較高；居群67的平均臂比與核不對稱系數最小，位于二維圖左下方，進化程度較低(圖3B)。因此，本研究認為扇穗茅居群83的起源較晚，進化程度較高；居群67的起源較早，進化程度較低。

圖3 扇穗茅不同居群染色體核型進化趨勢Fig.3 Evolution trend of chromosome karyotypes in different populations of L. racemosa

2.5 不同居群染色體核型聚類分析

扇穗茅染色體核型的聚類分析結果顯示，當遺傳距離為25時，扇穗茅的6個參試居群聚為A和B兩大分支，其中居群119，120，94和83聚為A支，居群67和84聚為B支，每個分支上的居群間親緣關系相對較近，不同分支居群間則具有相對較遠的親緣關系；當遺傳距離約為11時，扇穗茅的6個參試居群則形成3個分支，其中居群119，120和94聚為一支，居群83單獨形成一支，居群67和84聚為一支，相比居群94，居群83與居群120和119則具有相對較遠的親緣關系；當遺傳距離約為1時，居群119和120優先聚為一支，彼此間親緣關系相對最近。

圖4 扇穗茅不同居群染色體核型聚類分析Fig.4 Clustering analysis of chromosome karyotypes in different populations in L. racemosa

3 討論

研究表明，染色體作為遺傳物質的載體，其數目、形態和結構較為穩定，因而通過對植物染色體核型的綜合分析，不僅可以探究不同物種以及同一物種不同居群間的系統進化關系，而且也可為該物種的細胞學研究提供科學依據[22-23]。通過對扇穗茅6個不同地理居群染色體核型的比較分析，本研究發現扇穗茅所有居群的染色體均為二倍體、數目為28條(圖1)，然而染色體的相對長度、長度比、平均臂比等在扇穗茅的不同居群間卻存在一定差異。張建波等[24]基于川西北高原垂穗披堿草(Elymusnutans)12個居群染色體核型的研究，認為地理氣候環境可以顯著影響植物染色體核型的形態與結構，其也是造成染色體形態多樣性的主要原因；王亞男等[12]通過對內蒙古高原沙鞭6個居群染色體核型特征和進化關系的分析，發現生長環境不同導致了沙鞭不同居群的染色體形態特征產生差異，并逐漸形成穩定的生態型[25]。本研究中，扇穗茅的6個參試居群來自不同的地域，其分布的經緯度和海拔高度存在差異(表1)，據此我們認為扇穗茅6個參試居群的染色體形態差異也是由其地域分布和生態環境不同造成的，這與先前的研究結論是一致的[12,24-25]。

扇穗茅6個參試居群的染色體均為中部著絲點(m)和近中部著絲點(sm)染色體，其中中部著絲點染色體比例較高，這與先前報道的近緣種無芒雀麥(Bromusinermis)[26]和沙地雀麥(B.ircutensis)[27]的染色體核型類型相同。同時，通過對扇穗茅6個參試居群染色體核型的比較分析，本研究發現扇穗茅的染色體核型類型主要有2A,1B和2B三種，其中居群120是2A型、居群67是1B型、其余4個居群均為2B型(表3)，表明它們均具有較好的對稱性，與先前報道的無芒雀麥[28]、沙地雀麥[27]和扁穗雀麥(B.catharticus)[29]等的研究結果類似。Stebbins[19]認為，植物染色體核型由對稱性向不對稱性進化，對稱性越高染色體變異越小，進化程度越低；反之，非對稱性越高染色體變異越大，進化程度越高。因此，我們推測雀麥族植物可能是一個進化上較為保守的類群，進化水平相對較低；染色體形態和結構差異可能是由其生長環境不同導致的。此外，植物進化程度與其環境適應性密切相關[30]，通常對環境適應性越強的植物其進化程度往往越高[31]。據此，我們推測扇穗茅的居群83理應對環境具有較強的適應性，未來遺傳育種上可能具有潛在價值。

聚類分析可以利用樣本的多變量信息將其劃分為相對同質的集群，從而清晰地展現不同集群間的系統親緣關系[32]。本研究結果顯示，當遺傳距離為25時，扇穗茅6個參試居群聚為A和B兩大分支，其中居群119,120,94和83聚為A支，居群67和84聚為B支，同一分支上不同居群間具有相對較近的親緣關系；當遺傳距離約為1時，居群119和120優先聚類，彼此間親緣關系最近。同時，我們還發現分支A的4個居群分布于海拔相對較高的區域，而分支B的兩個居群分布的海拔高度相對較低。研究表明，隨著海拔高度的升高溫度會逐漸降低，并且降水、地表溫度及升溫速率等環境因子也會隨之發生改變[33]，因而我們認為扇穗茅6個參試居群的親緣關系可能與其分布的海拔高度和生境存在必然聯系。本研究首次報道了扇穗茅的染色體數目、核型特征及進化趨勢，為將來進一步探究扇穗茅屬乃至雀麥族植物的系統進化關系提供了有力的細胞學佐證。

4 結論

綜上所述，扇穗茅的染色體為二倍體，數目恒定，為2n=2x=28；染色體有中部著絲粒(m)型和亞中部著絲粒(sm)型染色體，其中中部著絲粒型染色體占比較高，包含2A，1B和2B三種類型；扇穗茅不同參試居群的染色體核型臂比和平均臂比差異較大，呈“雙向進化趨勢”；扇穗茅染色體總體沿二維圖右上角方向進化，即右上方居群具有較高的進化程度，左下方居群進化程度相對較低；聚類分析顯示，當遺傳距離為25時，扇穗茅6個參試居群聚為A和B兩大分支，每個分支上的居群間親緣關系相對較近，不同分支居群間親緣關系相對較遠。