引起食用菌蛛網病的Cladobotryum 屬3 種病原真菌的生物學特性研究*

蘭玉菲，唐麗娜，李秀梅，李曉穎，孔 怡**

（1.泰安市農業科學院，山東 泰安 271000；2.山東芝人堂藥業有限公司，山東 泰安 271000）

蛛網病是由菌寄生屬（Hypomyces） 真菌侵染引起的食用菌病害，該病可侵害多種食用菌，在歐洲、美洲和亞洲等地均已有報道[1-7]。近幾年通過對食用菌病蟲害發生情況調研發現，食用菌蛛網病在山東地區零星發生，但一旦發生會迅速蔓延，同時產生大量孢子，給菇農造成嚴重的損失。最初，于2014年在鄒城雙孢蘑菇（Agaricus bisponus） 工廠化廠房內發現類似蛛網病的病害，經柯赫氏法則驗證及形態學和分子生物學鑒定，其致病病原菌無性型為Cladobotryum mycophilum、 有 性 型 為 Hypomyces odoratus，這也是首次在中國發現由該病原菌引起的雙孢蘑菇蛛網病[8]。2017 年，在濟寧市金鄉縣金針菇（Flammulina velutipes） 菇棚內發現金針菇蛛網病，通過分子鑒定并結合形態特征，鑒定病原菌為金黃菌寄生菌，其有性型為Hypomyces aurantius(Pers.) Fuckel、無性型為Cladobotryum varium Nees[9]。2019 年，在泰安市農業科學院羊肚菌（Morchella spp）. 大棚中發現類似蛛網病的病害，通過分子鑒定并結合形態特征，鑒定其病原菌為Cladobotryum protrusum，首次向世界報道由C. protrusum 引起的羊肚菌蛛網病[10]。

基于前期對雙孢蘑菇蛛網病病原菌C. mycophilum 的生物學特性進行初步研究[11]，此次試驗擬對引起食用菌蛛網病的Cladobotryum 屬3 種病原真菌（C. mycophilum、C. varium 和C. protrusum） 的生物學特性進行比較和分析，以期為食用菌蛛網病的科學防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為前期研究中從山東省雙孢蘑菇、金針菇和羊肚菌上分離、鑒定并保存的蛛網病病原菌C. mycophilum、C. varium 和C. protrusum。

1.2 基礎培養基

基礎培養基配方：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂粉20 g，水定容至1 L。

1.3 病原菌在PDA 培養基上的培養特性和形態特征

將保存的病原菌分別接種到PDA 培養基上，于25 ℃恒溫黑暗培養。采用劃“十”字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲日生長速度，觀察并記錄初生菌絲顏色、菌落顏色變化、表面特征、色素產生情況等。利用BX41 顯微成像系統[奧林巴斯（中國） 有限公司] 觀察孢子形態和大小等，并拍照記錄。

1.4 溫度對菌絲生長的影響

將病原菌菌株在PDA 培養基上培養3 d～6 d，用打孔器取5 mm2菌落接種到PDA 平板上，分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃下黑暗培養，每個處理5 次重復。采用劃“十”字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲日生長速度并進行方差分析。具體方法參照參考文獻[11]。

1.5 碳源篩選

按照基礎培養基的配方，分別用蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖替代葡萄糖。制成平板培養基后分別接入菌絲塊，于25 ℃恒溫、黑暗培養，每個處理5 個重復。數據測量和分析方法同1.4。

1.6 氮源篩選

按照基礎培養基的配方，分別用牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨代替蛋白胨。數據測量和試驗方法同1.5。

1.7 病原菌菌絲致死溫度的測定

參照參考文獻[11]的方法，取培養好的新鮮菌絲分裝于離心管中，水浴10 min，水浴溫度分別設為35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃。無菌條件下將水浴處理的菌絲塊移至PDA 平板培養基上，25 ℃黑暗培養，每個處理5 個重復。根據試驗結果進一步按1 ℃梯度設計溫度梯度，進行相同處理，確定菌絲的致死溫度。

2 結果與分析

2.1 3 種病原真菌在PDA 培養基上的生長特性

將3 種病原真菌分別接種到PDA 平板上，25 ℃黑暗培養，觀察其培養特性。Cladobotryum 屬3 種病原真菌在培養過程中的菌落生長情況及顏色變化見圖1。

由圖1 可知，C. mycophilum 培養15 d 產生紅色色素，C. varium 培養至35 d 也未產生色素，C. protrusum 培養7 d 即開始產生紅色色素。如組圖A 所示，PDA 培養基上C. mycophilum 菌落初期為白色，氣生菌絲發達，而后逐漸變為淡黃色或粉紅色，后期整個培養基變成紅色；培養5 d～6 d 即可長滿整個平板。如組圖B 所示，PDA 培養基上C. varium 生長初期菌絲潔白濃密，菌落邊緣整齊，后期有粉狀分生孢子產生；該菌株不產生色素。如組圖C 所示，C. protrusum 在PDA 培養基上培養3 d～4 d 即可長滿直徑為90 mm 的培養皿；菌落初期為白色，而后逐漸變為黃色，后期呈磚紅色。

圖1 3 種病原真菌的生長及色素產生情況Fig. 1 Growth and pigment production of three kinds of pathogenic fungi

Cladobotryum 屬3 種病原真菌的微觀觀察形態特征記錄結果見表1。

表1 3 種病原真菌的微觀形態特征Tab.1 Micromorphological characteristics of three kinds of pathogenic fungi

如表1 所示，Cladobotryum 屬3 種病原真菌的分生孢子形態和大小存在差異。C. mycophilum 的產孢細胞大小為（25～40） μm ×（4～6） μm，頂端略尖（2 μm～4 μm）；分生孢子呈橢圓形或卵圓形，有時稍彎曲，大小為（16～24） μm×（6～8） μm，具有1～3 個分隔。C. varium 菌絲為有隔菌絲，在菌絲上形成分生孢子梗，分生孢子梗分枝并輪生，在小梗頂端形成分生孢子，分生孢子呈橢圓形，單細胞或雙細胞，大小為（12.4～16.8） μm ×（6.4～8.6） μm，無色透明。C. protrusum 的產孢細胞為多細胞，頂端有突起；分生孢子橢圓形，大小為（20.8～25.6） μm×（5.6～7.8） μm，透明至淡綠色，具有0～1 個分隔。

2.2 溫度對3 種病原真菌菌絲生長的影響

溫度對Cladobotryum 屬3 種病原真菌的菌絲生長影響結果見表2。

表2 不同溫度對3 種病原真菌菌絲生長的影響Tab.2 Effect of temperature on the mycelial growth of three kinds of pathogenic fungi

由表2 可知，C. mycophilum 在15 ℃～30 ℃均能生長；25 ℃時菌絲生長速度最快，其次是20 ℃，35 ℃菌絲停止生長。C. varium 在20 ℃和25 ℃時菌絲生長最快，其次是15 ℃，30 ℃時菌絲停止生長。C. protrusum 在15 ℃～35 ℃均能生長；在25 ℃時菌絲生長速度最快，其次是20 ℃和30 ℃，35 ℃時菌絲停止生長。因此，C. mycophilum 和C. protrusum生長最適溫度為25 ℃，C. varium 生長最適溫度為20 ℃～25 ℃。

2.3 不同碳源對3 種病原真菌菌絲生長的影響

不同碳源對Cladobotryum 屬3 種病原真菌的菌絲生長影響結果見表3。

表3 碳源對3 種病原真菌菌絲生長的影響Tab.3 Effect of carbon source on the mycelial growth of three kinds of pathogenic fungi

由表3 可知，Cladobotryum 屬3 種病原真菌在供試的5 種碳源培養基上均能生長。C. mycophilum菌絲在以乳糖、蔗糖和果糖為碳源的培養基上生長較快，且差異不顯著，其次是葡萄糖和麥芽糖；但在以乳糖為碳源的培養基上較稀疏，以其他4種碳源培養基上菌絲濃密，長勢好；因此C. mycophilum 最適碳源為蔗糖。C. varium 菌絲在以麥芽糖為碳源的培養基上生長最快，長勢好，且與其他4 種碳源條件下的菌絲生長速度差異顯著；因此C. varium 最適碳源為麥芽糖。C. protrusum 菌絲在以乳糖為碳源的培養基上生長最快，但長勢稀疏；其次是果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，且4種碳源差異不顯著；但在以葡萄糖為碳源的培養基上生長較稀疏；因此C. protrusum 最適碳源為果糖、蔗糖和麥芽糖。

2.4 不同氮源對3 種病原真菌菌絲生長的影響

不同氮源對Cladobotryum 屬3 種病原真菌的菌絲生長影響結果見表4。

表4 氮源對3 種病原真菌菌絲生長的影響Tab.4 Effect of nitrogen source on mycelial growth of three kinds of pathogenic fungi

由表4 可知，Cladobotryum 屬3 種病原真菌在供試的5 種氮源培養基上均能生長。C. mycophilum菌絲在以蛋白胨和牛肉膏為氮源的培養基上生長最快，二者差異不顯著，且長勢好；其次是酵母膏；在以硫酸銨和硝酸銨為氮源的培養基上生長最慢；因此C. mycophilum 最適氮源為蛋白胨和牛肉膏。C. varium 菌絲在以酵母膏為氮源的培養基上生長最快，且長勢好；其次是牛肉膏、硝酸銨和蛋白胨；在以硫酸銨為氮源的培養基上生長最慢；因此C.varium 最適氮源為酵母膏。C. protrusum 菌絲在以酵母膏為氮源的培養基上生長最快，且長勢好；其次是牛肉膏和蛋白胨；在以硝酸銨為氮源的培養基上生長最慢，因此C. protrusum 最適氮源為酵母膏。

2.5 3 種病原真菌菌絲致死溫度

C. varium 和C. protrusum 的菌絲在35 ℃～45 ℃水浴處理10 min 后仍可在PDA 培養基上繼續生長，當溫度高于50 ℃后均不能生長，進而在45 ℃～50 ℃范圍內按1 ℃梯度設計6 個溫度梯度進行處理。試驗發現C. varium 菌絲在46 ℃～50 ℃水浴處理后均不能再生長，由此確定其菌絲的致死溫度為46 ℃；C.protrusum 菌絲在48 ℃、49 ℃和50 ℃水浴處理后不能生長，由此確定其菌絲的致死溫度為48 ℃。前期研究中利用同樣方法確定了C. mycophilum 菌絲的致死溫度為49 ℃[11]。綜合分析表明3 種病原真菌的菌絲致死溫度存在差異，相比較C. mycophilum 和C.protrusum 更耐高溫。

3 小結

通過對引起食用菌蛛網病的Cladobotryum 屬3種病原真菌（C. mycophilum、C. varium 和C. protrusum） 的生物學特性進行比較和分析，發現3 種病原真菌在PDA 培養基上的培養特性和形態特征存在差異。C. protrusum 菌絲生長最快；C. mycophilum 和C. protrusum 培養后期均產生紅色色素，C. varium 培養至35 d 仍未觀察到有色素產生；C. mycophilum 和C. protrusum 生長最適溫度為25 ℃，C. varium 生長最適溫度范圍為20 ℃～25 ℃；C. mycophilum 菌絲致死溫度為49 ℃，C. varium 菌絲的致死溫度為46 ℃，C. protrusum 菌絲的致死溫度為48 ℃。此外，研究結果表明C. mycophilum 的最適碳源為蔗糖，最適氮源為蛋白胨和牛肉膏；C. varium 最適碳源為麥芽糖，最適氮源為酵母膏；C. protrusum 適宜生長的碳源為果糖、蔗糖和麥芽糖，最適氮源為酵母膏。研究結果能夠為深入研究蛛網病在食用菌中的發生規律、流行動態及綜合防治提供理論參考。