大白樁菇多酚的定向液態發酵條件優化*

李艷婷，郭 尚**，王海珍，王志偉，徐莉娜，郭霄飛，劉 欣**

（1.山西農業大學 山西功能食品研究院，山西 太原 030031；2.山西農業大學 園藝學院，山西 晉中 030801）

多酚類化合物主要包括兩類：一類是較大分子量的單寧和鞣質（分子量500 Da ～3 000 Da）；另一類是小分子量的酚類物質，如沒食子酸、花青素、鞣花酸等[1]。馬鈴薯、葡萄、食用菌、石榴等物質中均含有豐富的多酚類物質[2]。多酚化合物在抗氧化、抑菌、抗炎、抗癌細胞增殖及糖尿病、心血管疾病預防等方面均效果顯著[3-7]。因此具有開發功能食品、特膳食品與藥物的潛能，有較高的利用價值。

大白樁菇（Leucopaxillus giganteus） 屬擔子菌門（Basidiomycota） 傘菌目（Agricales） 白蘑科（Tricholomataceae） 白樁菇屬（Leucopaxillus）[8]，又名雷蘑、大青蘑，子實體大型，味道鮮美，營養豐富，還可治小兒麻疹、煩燥不安等[9-10]。此外，大白樁菇含有多糖、蛋白質、杯傘菌素等生物活性物質，具有清除過量自由基、提高免疫活性、抗腫瘤等生物學功能[11-14]。經測定，大白樁菇子實體中的多酚含量為12.64 mg·g-1[15]，顯著高于羊肚菌（Morchella esculenta） 10.18 mg·g-1、茶樹菇（Cyclocybe aegerita）9.99 mg·g-1、黃牛肝菌（Suillellus luridus） 9.54 mg·g-1、猴頭菇（Hericium erinaceus） 9.08 mg·g-1、姬松茸（Agaricus blaze）i 10.70 mg·g-1、灰樹花（Grifola frondosa） 7.98 mg·g-1[16]，極具研究價值。但目前對于大白樁菇多酚化合物的進一步研究尚處空白。

大白樁菇是臺蘑的代表菌類之一[17]。近年來，由于當地居民的過度采摘，其產量面臨著逐年縮減的威脅；另外，由于大白樁菇生長周期長，馴化難度大，目前尚未實現人工栽培。利用液體發酵獲取菌絲體是一種簡便、快捷的方法，具有周期短、方法簡單、易于控制、成本低等特點。有研究表明，液體培養得到的菌絲體和栽培得到的食（藥） 用菌子實體或菌核，不僅化學組成相似，且生理功能同樣相似[18]。因此，以大白樁菇為發酵菌株，以多酚含量為指標，采用單因素（碳源、氮源、碳氮比、pH） 試驗對大白樁菇液體發酵條件進行研究，在此基礎上采用響應面法對富集多酚的大白樁菇液體定向發酵工藝進行優化，以獲得高含量多酚物質，為今后該菌的進一步開發利用提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

大白樁菇菌株，保藏于山西農業大學山西功能食品研究院。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與液體菌種的制備

將大白樁菇菌種接種于固體培養基（馬鈴薯200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂粉20 g·L-1、磷酸二氫鉀1 g·L-1、維生素B110 mg·L-）1，24 ℃暗培養20 d。

采用打孔器挑取直徑為0.5 cm 已培養好的菌塊置于液體培養基（葡萄糖35 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、磷酸二氫鉀0.5 g·L-1、硫酸鎂0.25 g·L-1、維生素B110 mg·L-）1，25 ℃、150 r·min-1搖床避光培養15 d，作為液體菌種備用。

1.2.2 不同碳源對多酚含量的影響

利用5 種碳源（C1：葡萄糖；C2：海藻糖；C3：蔗糖；C4：麥芽糖；C5：乳糖） 代替1.2.1 液體培養基中的碳源（葡萄糖），添加量的質量濃度均為35 g·L-1，配制培養基。按5%的接種量接入液體菌種，24 ℃、130 r·min-1震蕩培養10 d，終止培養。用尼龍布（150 目） 分離菌絲體和發酵液，蒸餾水沖洗菌絲體3 次，60 ℃烘干至恒重，稱量，記錄。以不添加碳源的液體培養基為空白對照（CK1），每個配方設3 個重復。

1.2.3 不同氮源對多酚含量的影響

利用5 種氮源（N1：蛋白胨；N2：牛肉浸膏；N3：酵母粉；N4：硫酸銨；N5：麩皮） 代替1.2.1液體培養基中的氮源（蛋白胨），添加量的質量濃度均為6 g·L-1，配制培養基。接種及培養方法與1.2.2相同。以不添加氮源的液體培養基為空白對照（CK2），每個配方設3 個重復。

1.2.4 不同碳氮比對多酚含量的影響

以葡萄糖（含碳量40%） 為碳源，以蛋白胨（含氮量16%） 為氮源，在其他成分不變的條件下，通過調整葡萄糖的添加量使培養基中碳氮比分別為2.5 ∶1、10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1，每個配方設3 個重復。

1.2.5 不同pH 對多酚含量的影響

以葡萄糖為碳源，以蛋白胨為氮源，在其他成分不變的條件下，調整培養基pH 分別為4、5、6、7、8、9，每個配方設3 個重復。

1.2.6 菌絲體提取液的制備

將干燥后的菌絲體進行研磨，過60 目篩；精確稱取0.5 g，加入20 倍體積的水，設置溫度80 ℃，在超聲波中提取1 h；5 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即為水提液；重復提取，合并2 次的水提液。

沉淀物加入20 倍體積的無水乙醇，設置溫度為60 ℃在超聲波中提取1 h；5 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即為醇提液；重復提取，合并2 次的醇提液。

1.2.7 發酵液中菌絲體多酚含量

采用福林酚法對菌絲體多酚含量進行測定[19]；根據測定結果，計算發酵液中大白樁菇菌絲體多酚的含量。發酵液中菌絲體多酚質量濃度（ρp，mg·L-1） 的計算公式為：

式中：Ap為大白樁菇菌絲體多酚含量（mg·g-1）；ρm為干燥后大白樁菇菌絲體的質量濃度（g·L-1）。

1.2.8 響應面優化液體培養方案

在單因素試驗的基礎上，分別選取碳源（葡萄糖）、氮源（蛋白胨）、pH 為考察對象，以發酵液中菌絲體總多酚的質量濃度為響應值，利用Design-Expert 8.0 軟件設計3 因素3 水平試驗，每個試驗設置3 個重復。響應面3 因素3 水平試驗設計見表1。

表1 響應面試驗設計Tab.1 The test design of response surface

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 碳源對大白樁菇菌絲體及多酚的影響

液體發酵過程中，不同的碳源對干燥后大白樁菇菌絲體的質量濃度及其多酚含量的影響見圖1。

由圖1A 可知，與C6（CK1） 相比，其他5 種碳源均能提高大白樁菇的菌絲體質量濃度；其中C2海藻糖是積累菌絲體質量的最佳碳源，此時菌絲體質量濃度為5.17 g·L-1；其次為C1 葡萄糖和C3 蔗糖。如圖1B 所示，C1 葡萄糖有利于菌絲體多酚物質的積累，菌絲體水提多酚含量為8.15 mg·g-1，菌絲體醇提多酚含量為0.92 mg·g-1，菌絲體總多酚含量為9.07 mg·g-1；其次為C3 蔗糖和C4 麥芽糖。綜合試驗結果進行計算，C1～C5 發酵液中大白樁菇菌絲體水提多酚質量濃度分別為39.97 mg·L-1、9.10 mg·L-1、14.01 mg·L-1、9.25 mg·L-1、3.25 mg·L-1，C6（CK1） 為0.69 mg·L-1；菌絲體總多酚質量濃度分別為44.49 mg·L-1、11.28 mg·L-1、18.55 mg·L-1、11.89 mg·L-1、4.89 mg·L-1，C6（CK1） 為0.73 mg·L-1。綜上所述，最適合水提多酚及總多酚積累的碳源為葡萄糖，顯著高于其他4 種碳源及對照，多酚積累從高到低的碳源排序為葡萄糖＞蔗糖＞麥芽糖＞海藻糖＞乳糖。

圖1 不同碳源培養條件下大白樁菇干燥菌絲體的質量濃度（A） 及其多酚含量（B）Fig.1 Mass concentration (A) and polyphenol content (B)of dried mycelia of Leucopaxillus giganteus under different carbon source culture conditions

2.1.2 氮源對大白樁菇菌絲體及多酚的影響

液體發酵過程中，不同氮源對干燥后大白樁菇菌絲體的質量濃度及其多酚含量的影響見圖2。

由圖2A 可知，與N6（CK2） 相比，5 種氮源均能提高大白樁菇的菌絲體質量濃度；其中N2 牛肉浸膏和N4 硫酸銨能顯著提高大白樁菇菌絲體質量，二者無顯著性差異；其次為N1 蛋白胨。如圖2B 所示，N1 蛋白胨有利于菌絲體多酚物質的積累，菌絲體水提多酚含量為9.23 mg·g-1，菌絲體醇提多酚含量為2.21 mg·g-1，其次為N4 硫酸銨。綜合試驗結果，經計算N1～N5 發酵液中大白樁菇菌絲體水提多酚的質量濃度分別為38.23 mg·L-1、19.22 mg·L-1、18.54 mg·L-1、40.75 mg·L-1、7.90 mg·L-1，N6（CK2） 為0.96 mg·L-1；總多酚的質量濃度分別為47.41 mg·L-1、27.53 mg·L-1、21.51 mg·L-1、46.33 mg·L-1、9.29 mg·L-1，N6（CK2） 為3.23 mg·L-1。綜上所述，最適合水提多酚積累的氮源為硫酸銨，其次為蛋白胨，二者之間差異不顯著，但顯著高于其他3 種氮源及對照；最適合總多酚積累的氮源為蛋白胨，其次為硫酸銨，二者之間差異不顯著，但極顯著高于其他3 種氮源及對照，總多酚積累從高到低的氮源排序為蛋白胨＞硫酸銨＞牛肉浸膏＞酵母粉＞麩皮。

圖2 不同氮源培養條件下大白樁菇干燥菌絲體的質量濃度（A） 及其多酚含量（B）Fig.2 Mass concentration (A) and polyphenol content (B)of dried mycelia of Leucopaxillus giganteus under different nitrogen source culture conditions

2.1.3 碳氮比對大白樁菇菌絲體及多酚的影響

液體發酵過程中，不同的碳氮比對干燥后大白樁菇菌絲體的質量濃度及其多酚含量的影響見圖3。

圖3 不同碳氮比培養條件下大白樁菇干燥菌絲體的質量濃度（A） 及其多酚含量（B）Fig.3 Mass concentration (A) and polyphenol content (B)of dried mycelia of Leucopaxillus giganteus under different carbon-nitrogen ratio culture conditions

由圖3A 可知，碳氮比為10 ∶1 時菌絲體質量達到最大，隨著碳氮比的增大，菌絲體質量整體呈下降的趨勢；這可能是因為碳源含量過高，造成了富營養狀態，抑制了菌絲體的生長。如圖3B 所示，隨著碳氮比的增大，多酚含量呈先上升后下降的趨勢；碳氮比為20∶1 時菌絲體多酚的積累達最大，此時菌絲體水提多酚含量為8.37 mg·g-1，菌絲體醇提多酚含量為3.35 mg·g-1。綜合試驗結果，經計算碳氮比從2.5 ∶1 到50 ∶1 的發酵液中大白樁菇菌絲體水提多酚的質量濃度分別為16.80 mg·L-1、22.20 mg·L-1、19.00 mg·L-1、21.24 mg·L-1、14.80 mg·L-1和8.93 mg·L-1；總多酚的質量濃度分別為25.72 mg·L-1、38.32 mg·L-1、27.08 mg·L-1、34.62 mg·L-1、20.24 mg·L-1和15.21 mg·L-1。綜上所述，最適合水提多酚積累的碳氮比為10 ∶1，其次為30 ∶1 和20 ∶1，三者之間差異不顯著，但極顯著高于其他3 種碳氮比；最適合總多酚積累的碳氮比為10 ∶1，其次為30 ∶1，極顯著高于其他4 種碳氮比，總多酚積累從高到低的碳氮比排序為10 ∶1 ＞30 ∶1 ＞20 ∶1 ＞2.5 ∶1 ＞40 ∶1 ＞50 ∶1。葡萄糖的含碳量為40%，蛋白胨的含氮量為16%，總多酚積累最多的葡萄糖與蛋白胨的質量比值為4 ∶1。

2.1.4 pH 對大白樁菇菌絲體及多酚的影響

液體發酵過程中，不同pH 對干燥后大白樁菇菌絲體的質量濃度及其多酚含量的影響見圖4。

圖4 不同pH 培養條件下大白樁菇干燥菌絲體的質量濃度（A） 及其多酚含量（B）Fig.4 Mass concentration (A) and polyphenol content (B)of dried mycelia of Leucopaxillus giganteus under different pH culture conditions

由圖4A 可知，pH 為5 時菌絲體質量達到最大，其質量濃度為4.82 g·L-1；隨著pH 的增大或是減小，菌絲體質量均呈下降趨勢；因此，pH 5 最有利于菌絲體質量的積累。如圖4B 所示，pH 為5 時也有利于菌絲體多酚的積累，菌絲體水提多酚含量為8.62 mg·g-1，菌絲體醇提多酚含量為0.88 mg·g-1，其次是pH 6。綜合試驗結果進行計算，當pH 為4～9 時，發酵液中大白樁菇菌絲體水提多酚的質量濃度分別為16.56 mg·L-1、41.54 mg·L-1、28.86 mg·L-1、16.19 mg·L-1、7.54 mg·L-1和3.51 mg·L-1、；總多酚的 質 量 濃 度 分 別 為18.19 mg·L-1、45.77 mg·L-1、37.32 mg·L-1、19.98 mg·L-1、8.34 mg·L-1和3.91 mg·L-1。綜上所述，pH 為5 時最適合水提多酚及總多酚的積累，且顯著高于其他5 個pH 培養條件；總多酚積累從高到低的排序為pH 5 ＞pH 6 ＞pH 7 ＞pH 4 ＞pH 8 ＞pH 9。

2.2 響應面試驗優化

2.2.1 響應面實驗設計與結果

在單因素試驗的基礎上，以發酵液中總多酚質量濃度作為響應值，對葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、pH（C） 3 個因素進行3 因素3 水平的Box-Behnken試驗，試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計因素水平及結果Tab.2 Response surface test design and factor level

如表2 所示，根據各因素水平的結果，使用Design-expert 8.0 軟件進行擬合，發酵液中總多酚質量濃度（Y，mg·L-1） 的回歸方程為：

將各因素使用Design-expert 8.0 軟件對試驗結果進行統計分析，見表3。

表3 二次回歸方程方差分析Tab.3 ANOVA of quadratic regression equation

由表3 可知，模型P 值＜0.01，說明該模型有意義且達到了極顯著水平；失擬項P=0.620 5（P＞0.05），不顯著，表明該方程合理可靠。一次項A 對結果影響極顯著（P＜0.01），B 對結果影響顯著（P＜0.05），C 對結果影響不顯著（P＞0.05）；交互項AB、AC、AB 對結果影響均極顯著（P＜0.01）；二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01）。3 個單因素對發酵液中菌絲體總多酚質量濃度的影響主次順序為A＞C＞B，即葡萄糖＞pH＞蛋白胨。

2.2.2 響應面分析

根據分析結果及方程建立響應面，可直觀反映影響多酚質量濃度的3 個因素兩兩之間的交互作用，見圖5。

如圖5 所示，隨著葡萄糖、蛋白胨、pH 的增加，多酚質量濃度均出現先升高后降低的趨勢，且均出現極值，與方差分析結果一致。

圖5 葡萄糖、蛋白胨和pH 兩兩交互的響應面曲線Fig.5 Response surface curve of glucose, peptone and pH interacting in pairs

由響應面法分析得出的最佳培養方案中各組分的質量濃度分別為：葡萄糖22.40 g·L-1、蛋白胨6.12 g·L-1、磷酸二氫鉀0.5 g·L-1、硫酸鎂0.25 g·L-1、維生素B110 mg·L-1，pH 4.95。在此配方下進行5次驗證試驗，得出大白樁菇菌絲體發酵培養后總多酚的質量濃度為59.98 mg·L-1，與預測值（65.57 mg·L-1）接近，證明該培養方案是有效可行的。

3 討論與結論

食用菌屬于異養生物，主要由培養基提供生長所需的營養物質，如碳源、氮源、無機鹽、生長因子等[20-21]。此外，液體發酵過程中培養基的pH、搖床轉速、培養溫度、接種量等都會影響食用菌菌絲體的生長與發育。

碳源是食用菌最重要的營養源之一，為食用菌的生長發育提供能量[22]，大白樁菇液體發酵過程中均能利用供試的5 種碳源，對菌絲體多酚質量濃度的影響從大到小的順序依次為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、乳糖。葡萄糖有利于菌絲體多酚物質的積累，這與Barros 等[23]研究結果一致。氮源是菌絲生長過程中必需的營養物質[24]，大白樁菇液體發酵過程中均能利用供試的5 種氮源，對菌絲體多酚質量濃度的影響從大到小的順序依次為蛋白胨、硫酸銨、牛肉浸膏、酵母粉、麩皮。這與王謙等[25]的研究結果不一致，可能是由于采用的計算方法、培養方式不同以及培養基中的微量元素存在差異。液體發酵培養基可提供菌絲生長所需的各種營養物質，且適宜的營養比例可促進菌絲生長及次生代謝產物的積累。大白樁菇在液態發酵過程中，當碳氮比為10 ∶1 時，菌絲體質量、密度均能達到最大值。另外，由于培養液的pH 會隨著培養時間的增加發生變化，試驗中的pH 均為滅菌前所調試的初始pH，在初始pH 為5 時菌絲體質量可達最大，所含總多酚含最也高，因此大白樁菇液態發酵菌絲體多酚積累的最適pH 為5。

食用菌在液體發酵過程中會產生多種生物活性物質，主要來自于其胞內、胞外浸出液和發酵過程中產生的次級代謝產物，某些活性物質的含量可能遠高出子實體中的含量[26]。多酚類是食用菌代謝產物中最重要的組分之一，具有顯著的抗炎效果[27]。大白樁菇在液體發酵過程中，獲得最高菌絲體產量的培養基配方并不一定能積累到最大含量的多酚物質，表明了同一個培養基配方不能同時兼顧發酵產物中高菌絲體產量與高活性物質含量的獲得，這與林群英等[28]研究結果相一致。

試驗結果表明，葡萄糖、蛋白胨、pH 為5、碳氮比為10 ∶1（即葡萄糖和蛋白胨的質量比為4 ∶1）有利于菌絲體多酚物質的積累。在單因素試驗的基礎上，結合響應面分析法優化大白樁菇液體發酵工藝以獲得其更高多酚含量的菌絲體，其最佳配方為：葡萄糖22.40 g·L-1、蛋白胨6.12 g·L-1、磷酸二氫鉀0.5 g·L-1、硫酸鎂0.25 g·L-1、維生素B110 mg·L-1，pH 4.95。

試驗尚未對發酵周期進行研究，許多研究表明不同發酵時長對菌絲體質量及次級代謝產物的積累存在著顯著的影響，今后可在該方面進行深入研究，為大白樁菇及其多酚的開發利用提供更詳盡的參考依據。