接種內生真菌對藍莓幼苗生長生理效應的影響*

安常蓉，李 蕓，劉昌閎，崇慧影，文光琴，聶 飛，段如雁

（1 貴州省生物研究所，貴陽550009）

（2 貴州省植物園）

藍莓，也稱越橘，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生灌木果樹，是新興的經濟林樹種之一[1]。藍莓含有豐富的多種維生素、糖類、酸類以及多種礦質元素，具有多種食療保健功效，因此被營養學家稱為“21 世紀功能性保健漿果”，同時也是聯合國糧農組織推薦的人類五大健康食品之一[2]。

藍莓的根系沒有根毛，根系結構簡單，對水分和養分的吸收主要依賴于與其共生的菌根真菌[3]。1911 年，Coville[4]首先觀察到高叢藍莓根系中有菌根真菌寄生，并推測菌根真菌的侵染可能對藍莓生長有益。尤其是近20 年來對藍莓菌根的研究已成為熱點，更多研究表明，接種菌根真菌可以促進藍莓對土壤中礦質營養元素的吸收，促進植株生長，同時還調節植株自身內部的代謝活性，增強植株的抗性，提高藍莓的產量等[5-11]。亦有研究表明，接種菌根真菌對宿主植物的生長并沒有起到促進作用，接種內生真菌后宿主植物生長停滯、成活率降低等[12]。因此，接種后是否有促進效果受到多方面因素的影響，如植株因素、菌物因素等。對此，找出適合藍莓無性繁殖苗生長的共生菌根是有研究意義的。本文以1 年生藍莓無菌組培苗為研究材料，接種從栽培藍莓植株根系上分離純化的內生菌株菌液，通過定期監測苗木的生長，于生長旺期測定生理生化指標，生長結束期采集根系觀察侵染情況，并采集植株測定生物量，最終初步篩選出適合藍莓生長的菌株，這對于生產實踐中藍莓高效栽培具有理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）供試菌株。從畢節赫章和花溪高坡兩地采集不同栽培品種藍莓植株的根系，用冰盒帶回實驗室，將根系上土壤洗凈，用75%酒精浸泡1 min，然后用1‰HgCl2浸泡10 min，取其幼根，在無菌條件下，用經過消毒的剪刀剪成長0.5 cm 的根段，選用PDA 培養基，每個培養皿中放置6 個根段，后將培養皿倒置在培養箱內，25 ℃避光培養。待培養基長出菌落后再用接種環挑取無污染的菌落繼續在PDA 培養基進行純化培養，直至得到單一菌株。純化的菌株通過rDNA-ITS 全序列分析，對6 個菌株進行分子鑒定。

（2）供試植株。選擇生長一致的1 年生藍莓無菌組培苗，品種為萊克西。

（3）栽培基質。栽培基質為泥炭、草炭和珍珠巖等量混合，栽植前于121 ℃高壓滅菌2 h。

（4）栽培容器。外口徑14.5 cm、內口徑13.5 cm、高12.5 cm 和底徑10.2 cm 的塑料花盆于0.1%高錳酸鉀溶液中浸泡消毒0.5 h。

1.2 方法

供試菌株在PDA 培養基上純化后，接入PDB液體培養基上，于25 ℃下搖床培養7 d 左右。無菌組培苗種植5 個月后，將培養好的菌液澆灌藍莓苗根部，以不澆菌液為對照（CK），每株苗木澆灌50 mL，每個處理3 次重復，每次重復10 株苗，隔5 d 澆無菌水，其間不施加任何肥料。澆菌液前測定每株藍莓苗的苗高、地徑（地徑是苗干靠近基質處的直徑，在測量之前先標記好，便于后面的測量），以后每隔30 d 測1 次，連續監測5 個月。選擇持續向好的晴天，選擇苗木位置相同并充分展開的5 株標準株功能葉片，測定藍莓苗木的快速光響應指標和光譜效應指標，并采集葉片測定葉綠素含量。苗木生長結束后，選取每個處理10 株藍莓植株的生活根連帶部分根際土帶回實驗室，迅速清除根系表面的土粒和雜物，在自來水下沖洗干凈，放在已編號的包埋盒里，用蒸餾水反復沖洗干凈，放入10%KOH溶液中，將其置于90 ℃水浴鍋中3 h，期間再換1次10%KOH 溶液，再通過一系列的染色、分色和制片過程后，在光學顯微鏡下觀察菌根的侵染特征并拍照記錄，同時采集植株根系測定根系活力、生物量等指標。

1.3 指標的測定

（1）苗高、地徑的測量。用卷尺（精度0.1 cm）測量苗高，用游標卡尺（精度0.01 mm）測量地徑。

（2）生物量的測定。計算每個處理植株的平均地徑和平均苗高，按平均地徑和平均苗高±5%選取5 株標準株，采集植株前先把每株的所有葉片收集好，洗凈擦干后把根和莖（做好標記點以下的根系為根重，其余部分為莖重）分開，且分裝在不同的牛皮信封紙袋中，后放入105 ℃烘箱中殺青30 min，再用80 ℃烘至恒重，并稱量根、莖、葉各部分的干重。

（3）侵染率的計算。經染色的根段在乳酸甘油中脫色后，用剪刀剪取粗細均勻、長度約1 cm 的根段放在干凈的載玻片上，每個載玻片放5 個根段，加蓋干凈的蓋玻片，將壓片放在顯微鏡下進行觀察，每個處理放置8 個載玻片觀察。在觀察中，能夠觀察有菌絲的根段記為侵染的根段，相反，沒有觀察到任何菌絲侵染的根段為無侵染的根段。

侵染率（%）=（侵染的根段數/鏡檢根段總數）×100

（4）葉片光譜的測定。選擇持續向好的天氣，使用CI-710 光譜儀測定苗木位置相同并充分展開的5 株標準株功能葉片在400～1 000 nm 波長范圍內的透射率、吸收率和反射率參數，每個處理測定3 次，取平均值。分析全部葉片測定的吸收、透射和反射的光譜曲線，發現固定波長范圍內在470、550、670、780、880 nm 處有吸收峰，峰值波長漂移范圍較窄，一般在±5 nm 內。因此選擇波長位置位于470、550、670、780、880 nm 處的吸收光譜、透射光譜、反射光譜作為特征光譜變量。

（5）葉片光響應參數的測定。選擇持續向好的晴天，用Junior-PAM 葉綠素熒光儀測定PAR（光合有效輻射）和ETR（相對電子傳遞速率）等，對曲線進行擬合后得到光能利用效率（α）、最大電子傳遞速率（ETRm）以及最小飽和光強（Ik）3 個主要參數。

（6）生理生化指標的測定。參照文獻［13］，葉綠素含量的測定采用丙酮乙醇等比混合液法，根系活力的測定采用TTC 法。

1.4 綜合評價法的確定

由于各指標的單位、性質和數量的不同，故采用模糊數學隸屬度函數對各項指標測定值進行定量轉換[14]。即f（Xi）=（Xij-Ximin）/（Ximax-Ximin）和f（Xi）=（Ximax-Xij）/（Ximax-Ximin），其中f（Xi）為各指標隸屬度，Xij 表示各指標值，Ximax和Ximin 分別表示第i 項指標的最大值和最小值。將各處理的隸屬函數值求和，數值越大則綜合評價越高，并對不同處理的數值求和進行排序。

1.5 數據分析與處理

試驗數據采用Excel 2010 軟件進行統計和作圖，采用SPSS 23.0 軟件進行分析處理，采用Duncan’s 法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 通過ITS 序列分析的6 株菌株

通過鑒定分析，6 株菌株中有1 株藍狀菌屬，4株青霉素，1 株枝孢屬。其中，1 號菌株的最相似種為棘狀踝節菌，相似度為99.82%。2～5 號菌株雖然是同屬青霉素，但最相似種不同，2 號菌株的最相似種為柑橘青霉菌種，相似度為100.00%；3 號和5 號菌株最相似種為青霉菌種，相似度均為100.00%；4 號菌株的最相似種為油菜青霉菌種，相似度為99.81%。6 號菌株的最相似種為枝孢菌種，相似度為100.00%（表1）。

表1 通過ITS 序列分析的6 株菌株

2.2 接種不同菌株的藍莓根系侵染特征及侵染率

通過臺盼藍染色法對所有藍莓根系進行顯微觀察發現，侵染主要發生在根系為黃棕色的根段部分，菌絲的形態是由較粗的菌絲組成的密致的團狀，細胞被菌絲充滿。從表2 可以看出，接種不同內生真菌處理的藍莓根系均觀察到有侵染現象，且與CK相比差異顯著。其中，2 號菌株的侵染率最高，達57.5%；其次是1 號和4 號，侵染率均為52.5%；5號菌株的侵染率最低，為45.0%。6 個菌株處理的藍莓根系侵染率分別是CK 的4.2、4.6、4.0、4.2、3.6、3.8 倍。由此可見，沒有接種菌液的CK 雖然有侵染，但人工接種菌液處理的侵染率顯著高于CK。

表2 接種6 個菌株的藍莓根系侵染率

2.3 接種不同菌株對藍莓苗生長的影響

2.3.1 苗高和地徑

從表3 可以得知，人工接種菌液促進藍莓苗高生長。與CK 相比，1 號、2 號和4 號接種菌液處理的藍莓苗高生長顯著，3 號、5 號和6 號接種菌液處理的藍莓苗高差異不顯著。其中，接種1 號菌株處理的藍莓苗高生長最好，比CK 增長39.27%；其次是2 號和4 號菌株；苗高生長較差的是5 號菌株處理，增幅僅為15.25%。

表3 接種6 個菌株對藍莓苗高、地徑的影響

同樣，從表3 可以看出，人工接種內生真菌同樣促進藍莓苗木地徑的生長。其中，1 號、2 號和5號菌株處理的藍莓苗地徑生長量較大，與CK 相比差異顯著，3 號、4 號和6 號菌株與CK 相比差異不顯著，各菌株處理的藍莓苗地徑與CK 相比增長幅度為9.43%～21.43%。

2.3.2 生物量

由表4 得知，接種內生真菌的藍莓植株根、莖、葉的生物量和總生物量均高于CK。其中，接種2號菌株的藍莓植株葉生物量、根生物量和總生物量均高于CK 且差異顯著，分別是CK 的1.56、1.36、1.33 倍，接種1 號菌株的藍莓植株莖生物量最重，是CK 的1.48 倍。對于總生物量而言，接種菌根處理的藍莓植株均顯著高于CK。就生物量分配來看，各處理的植株呈現地上部分生物量＞地下部分生物量；對于植株的不同部位，接種2 號、3 號、6 號菌株處理以及CK 的根生物量大于葉生物量、莖生物量；接種1 號、4 號菌株處理的莖生物量大于根生物量、葉生物量；而接種5 號菌株處理的則是葉生物量高于根生物量、莖生物量。可見，內生真菌對藍莓植株的營養生長具有不同程度的促進作用，尤以接種1 號和2 號菌株的促進作用更明顯。

表4 接種6 個菌株對藍莓植株生物量及分配的影響

2.4 接種不同菌株對藍莓苗葉片光譜效應的影響

2.4.1 葉片吸收率

由表5 得知，在470 nm 左右，各處理的藍莓葉片平均吸收率最大，隨著波長的增加，藍莓葉片吸收率呈下降趨勢，550 nm 左右各處理葉片出現較低的吸收率；隨后，隨著波長的增加，葉片吸收率呈上升趨勢，在波長為670 nm 時藍莓葉片出現較大的吸收率，但隨著波長的繼續增加，藍莓葉片的吸收率明顯下降，在780 nm 后平穩下降。此外，接種內生真菌的藍莓葉片吸收率在各波長段均大于CK，表明接種菌株促進藍莓葉片對藍綠光和紅光的有利吸收。

表5 接種6 個菌株對藍莓葉片吸收率的影響

2.4.2 葉片反射率

從表6 可以看出，在測定波長范圍內，接種不同菌株處理的藍莓葉片反射率變化一致，葉片反射率在550 nm 左右出現峰值，之后在670 nm 左右葉片反射率最低，隨著波長的增加，在780 nm 左右反射率迅速上升，形成“紅邊”現象，最后在近紅外區域達到相對平穩，這與藍莓葉片吸收率變化趨勢不一致。另外，接種不同菌株處理的藍莓葉片反射率變化的峰值均小于CK。

表6 接種6 個菌株對藍莓葉片反射率的影響

2.4.3 葉片透射率

在測定波長范圍內，接種不同菌株處理的藍莓葉片光譜在550 nm 左右有較高的透射率（表7），在670 nm 左右其透射率降到最低，在780 nm 左右透射率快速增加，后隨著波長的增加其透射率平穩增加。另外，接種各菌株處理藍莓葉片透射率在470 nm 左右均大于CK，而在780 nm 和880 nm 左右其葉片透射率均小于CK，在其他波長范圍內的透射率與CK 相比無明顯的變化規律。

表7 接種6 個菌株對藍莓葉片透射率的影響

2.5 接種不同菌株對藍莓苗快速光響應主要參數的影響

通過對快速光響應曲線進行擬合，得到初始斜率（α）、最大電子傳遞速率（ETRm）、最小飽和光強（Ik）主要參數。由表8 得知，接種不同菌株對藍莓苗快速光響應主要參數的影響差異顯著。其中，快速光響應曲線的初始斜率表示光化學反應的啟動速率，沒有接種菌株（CK）的藍莓苗初始斜率最高，而接種1 號菌株處理的藍莓苗初始斜率顯著低于CK，其他菌株處理的藍莓苗初始斜率與CK 相比差異不顯著，可見在光能利用之初藍莓苗對光能利用效率變化不明顯。

接種不同菌株藍莓苗葉片最大電子傳遞速率與CK 相比差異顯著。其中，接種4 號菌株的藍莓苗葉片最大電子傳遞速率最高，其次是1 號菌株。各接種菌株處理的最大電子傳遞速率比CK 增加了33.11%～71.94%（表8）。

表8 接種6 個菌株對藍莓快速光響應主要參數的影響

接種不同菌株的藍莓苗最小飽和光強的變化與最大電子傳遞速率變化一致。接種不同菌株藍莓苗的最小飽和光強與CK 相比差異顯著，其中，接種4 號菌株的藍莓苗最小飽和光強最高，其次是1號菌株。各接種菌株處理的最小飽和光強比CK 增加了53.55%～110.59%（表8）。

綜合以上得出，接種4 號菌株的藍莓苗葉片電子傳遞速率快，對強光的耐受能力強于其他菌株處理。

2.6 接種不同菌株對藍莓葉片葉綠素含量和根系活力的影響

2.6.1 葉綠素含量

葉綠素是植物生長的主要光合色素，其含量可以在一定程度上反映植株進行光合作用的潛力。由表9 得知，接種6 個不同內生真菌處理的藍莓葉綠素a 含量與CK 相比差異不顯著；接種6 號菌株處理的葉綠素b 含量和葉綠素總含量與CK 相比差異顯著，接種其他菌株處理的葉綠素b 含量和葉綠素總含量與CK 相比差異不顯著。此外，接種6 號菌株處理的葉綠素總含量最高，為2.80 mg/g，是CK的1.5 倍；其次是2 號菌株處理，其葉綠素總含量為2.34 mg/g，是CK 的1.3 倍；接種5 號菌株處理的葉綠素總含量最低。相反，接種5 號菌株處理的葉綠素a/b 值最大，最小則為6 號菌株處理。

表9 接種6 個菌株對藍莓葉綠素含量的影響

2.6.2 根系活力

根系活力指標能夠間接反映根系生長情況和吸收營養狀況水平。從圖1 可知，接種不同菌株處理對藍莓苗木根系活力的影響差異顯著，其根系活力變化范圍為103.08～236.13μg/g FW·h。其中，1號菌株處理的藍莓苗木根系活力最大，為236.13μg/g FW·h；其次是2 號菌株處理，根系活力為186.57μg/g FW·h；苗木根系活力最小的是3 號菌株處理，為136.54μg/g FW·h。各處理的根系活力與CK 相比增幅為32.46%～129.07%。可見，接種菌株能顯著提高藍莓苗木的根系活力，從而促進植株對水分和養分的吸收。

圖1 接種6 個菌株對藍莓苗根系活力的影響

2.7 接種不同菌株處理的綜合評價

由于各指標的單位、性質和數量的不同，采用模糊數學隸屬函數法對各項指標進行定量轉換。選用侵染率、苗高、地徑、生物量、最大電子傳遞速率（ETRm）、葉綠素總含量和根系活力作為隸屬函數綜合評價指標。評價結果表明，接種不同菌株后對藍莓苗促生效果最為顯著的是1號和2號菌株，其次是4 號和6 號菌株，相對較差的是3 號和5 號菌株（表10）。由此可以初步篩選對藍莓苗促生效果較好的菌株為1 號、2 號、4 號和6 號。

表10 接種不同菌株對藍莓苗生長生理指標的綜合評價

3 討論與結論

根系侵染率是菌株侵染根系效果的直接體現，而根系的侵染受土壤條件和真菌源數量等因素的影響[15-16]，因此，有報道人工種植的藍莓菌根形成率普遍較低[17]。肖軍等以發酵菌液的方式對藍莓進行接種，接種后藍莓根系侵染率最高為63.3%[18]。本研究結果表明，在人工栽培藍莓中接種不同種類的內生真菌，其侵染率最高可達57.5%，與前人的研究結果相似。另外，幾種菌株處理的侵染率不一致，可能的原因是不同菌株與藍莓根系的親和力以及受其他因素影響的適應性不同所致。

菌根真菌對宿主植物水分、養分吸收最終體現在對植株生長的影響上。大量研究發現接種不同種類的菌株均對藍莓的生長有顯著的促進作用[19-22]。本研究結果同樣表明，接種內生真菌均顯著促進了藍莓苗的生長，但各菌株對藍莓苗生長以及對植株的不同部位生長效果不同，可能原因是各個菌株發揮作用存在差異性。

植物的生理生化特征決定了其對光譜的吸收、反射和透射的變化，而植物的生理特性又相應地反映了它的長勢情況。其中，色素是影響植物在可見光區域內光譜特征的決定性因素。因此，可以通過檢測植株對光吸收、反射和透射的變化間接估測葉綠素以及葉片水分含量的變化[23-24]。結合前人的研究，通過對比葉片吸收、透射和反射光譜曲線，選擇470、550、670、780、880 nm 作為特征光譜波段，結果表明藍莓葉片對光的吸收、反射和透射率都會隨著波長的變化而有所不同。總體變化規律為各處理的葉片吸收率的峰值均大于CK，葉片反射率的峰值均小于CK，而葉片透射率與CK 相比無明顯的變化規律，說明接種內生真菌能夠促進藍莓苗葉片對光能的吸收，而減弱光對葉片的反射和透射。

根系是植物吸收外界養分和水分的主要器官，而根系活力綜合反映了根系養分吸收和物質合成能力。有研究表明藍莓根系發育狀況及藍莓對菌根的依賴性與根系活力密切相關[25]。本研究中，接種6 種內生真菌都顯著地提高了藍莓苗的根系活力，從而促進了藍莓植株的生長。

為了更直觀地評價接種某種菌株對藍莓苗侵染、生長生理效應的影響，選用侵染率、苗高、地徑、生物量、最大電子傳遞速率、葉綠素總含量和根系活力作為隸屬函數綜合評價指標，評價結果表明，接種不同內生真菌后對藍莓苗促生效果最為顯著的是1 號和2 號菌株，其次是4 號和6 號菌株，相對較差的是3 號和5 號菌株，由此可以初步篩選對藍莓苗促生效果較好的菌株為1 號、2 號、4 號和6 號。但對于自然環境中的栽培藍莓而言，某種菌根真菌并不是單獨孤立存在的，而是以多樣性的方式存在。因此為了更好地模擬自然界中真菌-植物根系的共生狀態，研究2 種或2 種以上的菌株共同接種對藍莓苗生長發育的影響是今后研究的重點，這樣能更好地提高植株的侵染率以及為生產實踐服務。