賀蘭山東坡不同海拔典型植被帶土壤微生物磷酸脂肪酸分析

馬進鵬,龐丹波,陳 林,萬紅云,陳高路,李學斌,*

1 寧夏大學西北退化生態系統恢復與重建教育部重點實驗室,銀川 750021 2 寧夏大學西北土地退化與生態恢復國家重點實驗室培育基地,銀川 750021 3 寧夏大學農學院,銀川 750021 4 寧夏大學生態環境學院,銀川 750021

土壤微生物作為土壤生態系統的重要組成成分,在土壤形成、發育和土壤養分轉化等方面發揮重要作用[1],此外,土壤微生物也被認為是評價土壤質量的重要指標[2]。森林生態系統作為陸地生態系統的重要組分,其功能很大程度上依賴于植物與土壤生物之間的相互關系,其中土壤微生物的數量多、生物量大、多樣性高[3],在陸地生態系統的生物地球化學循環中具有不可替代的作用[4]。植物-微生物相互作用是土壤養分循環、能量流動等生態系統過程的重要驅動力,植物群落特征及多樣性對土壤微生物群落組成存在很大影響[5]。

在山地森林生態系統中,海拔變化很大程度上改變了土壤微環境,是影響土壤微生物組成和多樣性的重要因素[6],近年來受到越來越多的學者關注。王穎等[7]研究青藏高原高寒草甸海拔4300—5100m土壤微生物群落結構,發現在中部海拔地區(4800m)土壤微生物多樣性及微生物活性最高,表明土壤微生物多樣性是多因素綜合結果。孟苗婧等[8]采用PLFA法研究海拔的變化對鳳陽山土壤微生物群落的影響,發現海拔變化引起土壤性質的改變,對土壤微生物相對豐度影響程度不同。進一步說明,不同的微生物類群在不同的海拔適應程度不同。馮曉川等[9]利用高通量測序技術分析廬山國家級自然保護區森林土壤細菌群落特征,發現細菌群落多樣性沿海拔并未表現出差異。可見在不同研究區域土壤微生物特征有較大差異,一定區域土壤微生物的研究能很好的揭示該區域生態系統功能的穩定性。早期劉秉儒等[10—11]利用Biolog微平板法和磷酸脂肪酸甲酯法系統的研究了賀蘭山不同海拔植被帶微生物群落特征及分布規律,而對賀蘭山自然保護區局部區域土壤微生物群落的定量分析研究較少。土壤微生物群落功能及多樣性在維持生態系統功能和穩定、土壤質量檢測、植被恢復等方面起著重要作用[12],由此可見,研究賀蘭山自然保護區東坡土壤微生物群落特征及多樣性具有十分重要的科學意義。

賀蘭山是我國西北地區的一道生態屏障[13],是我國重要的氣候和植被過渡帶,山地植物群落垂直分異明顯[14],隨著海拔升高,依次有荒漠化草原、山地疏林草原、山地針葉林和亞高山灌叢草甸或高山草地等植被類型[10]。賀蘭山自然保護區東坡植被面積差異較大、優勢度高、植被景觀連通性好[15]。本研究選取海拔1300—2500m之間5個典型植被帶,采用PLFA法測定土壤微生物群落組成及多樣性,旨在為賀蘭山自然保護區東坡的管理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

賀蘭山位于阿拉善高原和銀川平原之間(地處北緯38°27′—39°30′,東經105°41′—106°41′之間),山體孤立,主峰海拔3556m。由于地處典型大陸性氣候范圍,具有明顯山地氣候特征,年均氣溫-0.8℃,年均降水量420mm,年均蒸發量2000mm,降水量具有明顯垂直分異現象,平均每上升100m,降水量增加13.2mm,降水量主要集中6—8月份,占全年降水量的60%—80%。賀蘭山東坡植被有明顯垂直分布規律,從上至下依次為高山草甸、山地針葉林、山地疏林草原和荒漠化草原[16—17]。

1.2 樣品采集

于2020年7月中旬在賀蘭山東坡海拔1300—2500m之間,沿海拔選取以短花針茅為建群種的荒漠草原(HM),以蒙古扁桃為建群種的山地旱生灌叢(MG),以油松為建群種的溫性針葉林(YS),以油松、杜松、山楊為優勢種的針闊混交林(HJ),以青海云杉為建群種的寒溫針葉林(QH)等5種典型植被帶,每個植被帶內選取海拔1380、1650、2139、2249、2438m,按等高線設置3個取樣點(樣地基本情況見參考文獻[18]),每個取樣點去除地表枯落物和腐殖質或剝離表土后用直徑4cm的土壤取樣器按五點取樣法取0—10cm土壤樣品5個,混合后作為該樣點土壤樣品并用自封袋密封后裝入冰盒帶回實驗室。去除土壤樣品中的植物根系和石塊,過2mm篩后分成2份,1份放入-80℃冰箱進行土壤微生物測定,另1份自然風干進行土壤理化性質測定。

1.3 測定方法1.3.1 土壤理化性質測定

采用pH計測定土壤pH；采用烘干法測定土壤容重(BD)；采用環刀法測定土壤含水量(WC)；采用重鉻酸鉀外加熱法測定土壤有機碳(SOC)；采用凱氏定氮法測定土壤全氮(TN)；采用HClO4-濃H2SO4外加熱消煮法、分光光度法測定土壤全磷(TP)[19]。

1.3.2土壤微生物群落結構測定

采用磷酸脂肪酸(PLFA)法[20]測定土壤微生物群落組成,用修正的Bligh-Dyer法進行脂類提取和磷脂脂肪酸分析；土樣用體積比為1∶2∶0.8的氯仿∶甲醇∶檸檬酸緩沖液振蕩提取總脂類,然后經SPE硅膠柱分離得到磷脂脂肪酸,將得到的磷脂脂肪酸進行堿性甲醇化,用Agilent 6890N氣相色譜儀分析PLFA的成分,內標為正十九烷酸甲酯(19∶0)[21],含量用nmol/g表示。

1.3.3磷酸脂肪酸的命名

脂肪酸鏈長以碳原子總數計算,從羧基開始,冒號后數字代表雙鍵數目,ω后數字代表雙鍵的位置(從羧基端算起)。c表示順式雙鍵,t表示反式雙鍵,i表示順式支鏈,a表示反式支鏈,br表示不確定支鏈位置,Me表示甲基位置,cy表示環丙基。由于不同菌群的PLFA特征圖譜不同,在高度專一性基礎上具有多樣性,因此可以作為微生物群落中不同群體的標記物[22]。磷脂的不同可以說明土壤樣品中微生物群落結構的不同,進一步對微生物進行識別和定量描述,為進一步研究提供信息。脂肪酸12:0,13:0,14:0,15:0,16:0,22:0,24:0等表示細菌；i13:0,a13:0,i14:0,a14:0,i15:0,a15:0,i17:1ω9c,i15:1ω6c等表示革蘭氏陽性細菌(G+)；14:1ω5c,16:1ω7cDMA,17:1ω8c,17:0cyclo ω7c,19:0cyclo ω7c,10:0 2OH,16:0 2OH等表示革蘭氏陰性細菌(G-)；18:1ω9c,21:0,23:0,18:2w6c等表示真菌；10Me 17:0,10Me 18:1ω7c,10Me 19:1ω7c,10Me 17:1ω7c,10Me 18:0等表示放線菌；20:4ω6c,20:3ω6c,20:5ω3c,19:3ω6c等表示原生動物[23—29]。

1.4 數據處理

用Excel進行數據處理,用SPSS進行方差分析(ANOVA)(P<0.05)(選擇最小差異性顯著(LSD)檢驗),用Origin 2018進行聚類分析(cluster analysis)(選擇歐氏距離-最小距離法系統聚類)、相關性分析和繪制熱圖,用Canoco5進行主成分分析(PCA)。

微生物多樣性分析采用Shannon-Wiener(H)、Brillouin多樣性指數(B)和Pielou均勻度指數(J)、Simpson優勢度指數(D)、Mcintosh多樣性指數(M)等方法。

(1)Shannon-Wiener多樣性指數(H),計算公式為：

H=-∑PilnPi

(1)

式中,Pi=Ni/N,Ni為處理i的特征脂肪酸個數,N為實驗中總特征脂肪酸個數。

(2)Brillouin多樣性指數(B),計算公式為：

(2)

式中,n1為第1個PLFAs生物標記的個體數量,n2為第2個PLFAs生物標記的個體數量,ni為第i個PLFAs生物標記的個體數量,N為所有處理中PLFAs生物標記出現的個體總和。

(3)Pielou均勻度指數(J),計算公式為：

J=-∑PilnPi/lnS

(3)

式中,S為群落中PLFA總數。

(4)Simpson優勢度指數(D), 計算公式為：

D=1-∑Pi2

(4)

式中,Pi為i種特征PLFA占該試驗中總的特征脂肪酸個數比例。

(5)Mcintosh多樣性指數(M),計算公式為：

(5)

式中,N為特征PLFA總數。

2 結果分析

2.1 不同海拔植被帶土壤基本性質的比較

分析不同海拔土壤因子(圖1),可以得出土壤有機碳(SOC)、土壤全氮(TN)、土壤全磷(TP)、pH、土壤容重(BD)、土壤含水量(WC)在不同海拔植被帶之間差異性顯著(P<0.001),其中SOC、TN、WC均隨海拔升高而增大,pH、BD隨海拔升高而降低。

圖1 不同海拔植被帶土壤理化性質Fig.1 Physical and chemical properties of soil in typical vegetation types at different altitudes

2.2 不同海拔植被帶土壤微生物PLFA含量比較

從不同海拔植被帶土壤中共檢測到59種PLFA生物標記(表1)。其中HM土壤中PLFA生物標記有50種,總含量為(57.99±5.31)nmol/g,MG土壤中PLFA生物標記有56種,總含量為(84.58±28.73)nmol/g,YS土壤中PLFA生物標記有55種,總含量為(96.64±16.78)nmol/g,HJ土壤中PLFA生物標記有54種,總含量為(83.97±38.52)nmol/g,QH土壤中PLFA生物標記有57種,總量為(86.02±21.75)nmol/g。不同海拔植被帶土壤微生物的PLFA種類差別不大,而不同類型微生物的PLFA含量有明顯差異,YS土壤中PLFA生物標記總含量最高,QH土壤中PLFA生物標記種類最多,每種類型土壤中均有不同的生物標記,代表著不同類型的微生物。在5種植被帶土壤中完全分布的PLFA生物標記有49種,而有些PLFA生物標記只在某種植被帶土壤中有分布,屬于不完全分布,此類PLFA生物標記有10種,如生物標記13:0,21:0,10Me 19:1ω7c僅在HM土壤中未出現,i19:0僅出現在MG和QH土壤中,15:1ω6c僅出現在YS和HJ土壤中,17:0 DMA僅出現在QH土壤中,10:0 2OH,16:0 2OH僅在HM和HJ土壤中未出現,10:0 3OH僅出現在HJ和QH土壤中,18:2 DMA僅出現在HM和MG土壤中。

表1 不同海拔植被帶土壤微生物的PLFA類型及含量/(nmol/g)Table 1 Types and contents of PLFA in soils with different vegetation

5種植被帶土壤微生物中PLFA生物標記含量較高的是16:0,18:0(細菌),i15:0,i16:0,a15:0,a17:0,a11:0,a12:0,i17:1ω9c(G+),16:1ω5c(叢枝菌根真菌),17:0cyclo ω7c,19:0cyclo ω7c,16:1ω7c(G-),18:1ω9c(真菌),18:1ω7c(甲烷氧化菌),10Me 16:0(脫硫桿菌/放線菌),18:2ω6c(腐生真菌),10Me 18:0(放線菌),在土壤PLFA生物標記總量中占有一定優勢,所占百分比依次為80.29%,78.27%,75.40%,79.17%,78.61%,說明其在土壤中起主要作用。由此可見在不同的海拔植被帶土壤中微生物的種類和含量存在差異,表明不同的土壤環境中微生物起著不同的作用。

2.3 不同海拔植被帶土壤特征微生物類群PLFA含量比較

不同海拔植被帶土壤特征微生物PLFA含量存在差異,總含量及其相互之間比值(圖2)。可見土壤微生物中細菌的種類最多且含量最高,其次是真菌和放線菌,而原生動物的含量相對較少。細菌、真菌之間,革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌之間PLFA含量有明顯差異,相互之間比值較大。YS土壤中真菌、細菌、原生動物、放線菌PLFA含量最多,而HM土壤中含量最低,革蘭氏陽性細菌PLFA含量表現為YS>MG>QH>HJ>HM,革蘭氏陰性細菌表現為YS>HJ>QH>MG>HM。真菌/細菌表現為YS>HJ>QH>MG>HM,革蘭氏陽性細菌/革蘭氏陰性細菌表現為HM>MG>QH>YS>HJ。

圖2 不同海拔植被帶土壤中的特征微生物類群PLFA總量(nmol/g)及比值Fig.2 Contents and ratio of Microbial groups PLFA in soils with different vegetationHM：荒漠草原 Desert steppe；MG：蒙古扁桃 Amygdalus mongolica (maxim) ricker；YS：油松林 Pinus tabulaeformis forest；HJ：混交林 Mixed forest；QH：青海云杉林 Picea crassifolia Kom forest

2.4 不同海拔植被帶土壤微生物群落結構比較

以不同海拔植被帶土壤中PLFA標記的生物量為指標構建矩陣,以歐式距離為尺度,用最小距離法進行系統聚類分析(圖3)。不同植被帶的土壤PLFA生物標記可分成不同的類群。如表征甲烷氧化菌的18:1ω7c和18:1ω6c,表征非特異性細菌的16:0,表征脫硫桿菌的10Me 16:0,表征革蘭氏陰性細菌的16:1ω7c,表針真菌的18:1ω9c和腐生真菌的18:2ω6c,其特征表現為完全分布且含量高,剩余的生物標記則表現為分布不完全且含量低。可以看出在不同的海拔植被帶下有的微生物類群組成和含量并不會隨環境變化而發生變化,而有的微生物類群可能更適合在某種特定的環境條件下生存。

圖3 不同海拔植被帶土壤微生物群落PLFAs生物標記的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of PLFAs biomass of microbial community in soils with different vegetation

選取不同海拔植被帶共有的PLFA生物標記含量繪制熱圖(圖4),由圖可知不同的PLFA生物標記在不同的海拔植被帶分布不同,有的PLFA生物標記在某一植被帶的含量明顯高于其他植被帶,可見其表征的微生物在該區域有著更好的生境條件,整體可以看出在YS土壤中PLFA生物標記含量要高于其他植被帶。

圖4 不同海拔植被帶土壤微生物群落PLFAs生物標記熱圖Fig.4 Heatmap of PLFAs biomass of microbial community in soils with different vegetation

2.5 不同海拔植被帶土壤微生物群落多樣性指數

不同海拔植被帶土壤微生物群落多樣性指數(表2),在Shannon-Wiener多樣性指數上HJ要高于其海拔植被帶,在Brillouin多樣性指數上QH和HJ要高于其他海拔植被帶,從均勻度指數看HJ要高于其他海拔植被帶,在Simpson多樣性指數上HJ要高于其他海拔,在Mcintosh多樣性指數上HJ高于其他海拔植被帶。

表2 不同海拔植被帶土壤微生物類群多樣性指數Table 2 Soil microbial communities′ diversity indices in soils with different vegetation

2.6 不同海拔植被帶土壤PLFA種類、含量及多樣性指數相關分析

對不同海拔植被帶土壤PLFA種類、含量及多樣性指數Pearson相關性分析(表3),PLFA種類與PLFA含量和Brillouin指數顯著正相關；PLFA含量與Brillouin指數顯著正相關；Shannon-Wiener指數與均勻度指數、Simpson指數和Mcintosh指數顯著正相關；均勻度指數和Simpson指數均與Mcintosh指數顯著正相關。

表3 土壤PLFA生物標記種類、含量及微生物多樣性指數Pearson相關性分析Table 3 Pearson′s correlation analysis of soil PLFA biomarker species, content and microbial diversity index

2.7 不同海拔植被帶土壤微生物類群分析

由不同海拔植被帶特征土壤微生物類群主成分分析(圖5)表明,與土壤微生物群落相關的2個主成分累計貢獻率為86.81%,其中,第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)解釋量為78.01%和8.80%,對第1主成分起主要作用的微生物類群有非特異性細菌、革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、真菌、放線菌和原生動物等,對第2主成分起主要作用的微生物類群為厭氧細菌。不同海拔植被帶土壤微生物類群分布在主成分坐標平面的不同位置,可見不同海拔植被帶的土壤微生物群落存在差異。取樣點距離的遠近代表著取樣點微生物群落結構的相似程度,距離越近則相似度越高,可見HM土壤微生物群落結構與MG、QH和YS土壤微生物群落結構相似度高,HJ土壤微生物群落結構與其他植被帶土壤微生物群落結構相似度低。

圖5 不同海拔植被帶土壤微生物群落主成分分析 Fig.5 Principal components analysis of different microbial group′s PLFA in soils with different vegetationa：非特異性細菌 Nonspecific bacteria；b：革蘭氏陽性細菌 Gram-positive bacteria；c：革蘭氏陰性細菌 Gram-negative bacteria；d：甲烷氧化菌 Methanotrophs bacteria；e：厭氧細菌 Anaerobic bacteria；f：脫硫桿菌 Thiobacillus；g：真菌 Fungi,h：腐生真菌 Saprophytic fungi；i：叢枝菌根真菌 Arbuscular mycorrhizal fungi；j：放線菌 Actinomycetes；k：原生動物 Protozoa

2.8 不同海拔植被帶土壤微生物含量及多樣性指數與土壤因子的關系

對不同海拔土壤性質與土壤微生物類群及多樣性指數進行相關性分析(圖6),發現海拔及各土壤因子對微生物類群及多樣性指數影響并不顯著,其中海拔與腐生真菌有顯著正相關關系,海拔、SOC、TN與微生物類群及多樣性指數正相關,pH、BD與微生物類群及多樣性指數負相關。可見海拔的變化引起土壤微環境的改變,對土壤微生物的群落組成及多樣性存在影響。

圖6 不同海拔植被帶土壤微生物含量及多樣性指數與土壤因子的相關性分析Fig.6 Correlation analysis between soil microbial content, diversity index and soil factors with different altitude vegetationSOC: 土壤有機碳 Soil organic carbon; TN: 全氮 Total nitrogen; TP: 全磷 Total phosphorus; BD: 容重 Bulk density; WC: 土壤含水量 Water content; G+: 革蘭氏陽性細菌 Gram-positive bacteria; G-: 革蘭氏陰性細菌 Gram-negative bacteria;H: Shannon-Wiener指數 Shannon-Wiener index; B: Brillouin多樣性指數 Brillouin index; J: Pielou均勻度指數 Pielou index; D: Simpson優勢度指數 Simpson index; M: Mcintosh多樣性指數 Mcintosh index

3 討論

3.1 不同海拔植被帶土壤微生物含量變化特征

土壤微生物群落組成及多樣性既可以反映土壤的生物活性也可以反映土壤的生態脅迫機制[30]。本研究

運用PLFA法定量研究了賀蘭山自然保護區東坡不同海拔植被帶土壤微生物群落結構及多樣性,從不同海拔植被帶共檢測出59種PLFA生物標記,發現QH土壤中PLFA生物標記的種類最大,YS土壤中PLFA生物標記的含量最大。趙銀[31]研究了青藏高原高寒草甸土壤微生物群落共檢測出70種PLFA生物標記；鄭潔[24]研究閩江口紅樹林土壤微生物群落共檢測出22種PLFA生物標記；吳則焰等[32]研究了武夷山不同海拔植被帶土壤微生物群落多樣性共檢測出25種PLFA生物標記；可見賀蘭山自然保護區東坡土壤中PLFA生物標記種類較多,間接反映出自然保護區微生物較為豐富,這與劉秉儒等[10]研究的賀蘭山不同海拔典型植被帶土壤微生物多樣性所檢測出28種PLFA生物標記的結果有所差異,微生物對環境的變化極為敏感,其差異原因可能與采樣點的選擇及測定方法存在不一有關。在不同海拔植被帶土壤中,除了PLFA生物標記的種類和含量不同之外,研究發現特征微生物的含量也存在差異,細菌含量最大,其次是真菌、放線菌,原生動物含量最小。隨著海拔的升高土壤微生物的含量先升高后降低,在YS土壤中微生物含量最高,可見隨著海拔的升高,溫度降低,濕度增加[15],在該植被帶較好的水熱生存條件是微生物含量高的主要原因。QH植被帶有著較厚的凋落物層,凋落物作為微生物生存所需能量來源的主要提供者,較厚的凋落物層增加了土壤-微生物之間的協同作用,這可能是該植被帶PLFA生物標記種類多的原因[33]。

3.2 不同海拔植被帶土壤微生物結構及多樣性特征

G+和G-是細菌群落的兩大主要類群,G+/G-可以反映細菌群落的多樣性特征,同時其還可以表征土壤肥力[34],研究發現HJ土壤中G+/G-最小說明該植被帶營養脅迫小,這與該植被帶豐富的物種多樣性有很大關系,產生的豐富凋落物為微生物提供了更多資源條件[35]。真菌和細菌作為土壤微生物最主要的類群,真菌/細菌可以間接反應土壤微生物的生存環境[36],研究表明在YS土壤中中真菌和細菌含量高于其他植被帶,同時真菌/細菌最大,這與劉秉儒等[10]研究結果發現賀蘭山在海拔1900—2100m處真菌含量最高的結果一致,也有研究[17]發現賀蘭山東坡YS土壤微生物熵最大,而微生物熵可以反映土壤有機質的輸入量、微生物碳的轉化速率及土壤質量好壞,這也進一步說明該海拔植被帶環境條件更適合土壤微生物生存[37]。

目前應用較廣的微生物多樣性指數,如Shannon-Wiener多樣性指數、均勻度指數和Mcintosh多樣性指數等,基本可以表示土壤微生物多樣性的特征[38]。研究發現賀蘭山自然保護區東坡不同海拔植被帶微生物多樣性指數在HJ植被帶中最大,HJ植被帶中植物群落類型多樣,而植物物種組成及多樣性能夠明顯改變土壤微生物的群落結構及多樣性,同時HJ植被帶中豐富的凋落物層為土壤微生物提供生存所需的物質和能量,這是該海拔植被帶微生物多樣性高的主要原因[23,39]。研究發現某些表征微生物的PLFA生物標記在各植被帶含量較高,說明其并不會因為環境改變而發生變化,表明其在植被帶土壤中起主要作用[22]。而有的PLFA生物標記在某一植被帶含量明顯高于其他植被帶,說明其表征的微生物在該植被帶有獨特的作用[32]。不同海拔植被帶土壤微生物多樣性及其變化能很好指示該區域森林生態環境和系統功能變化,進一步為自然保護區土壤微生物的研究提供依據。

3.3 不同海拔植被帶土壤微生物群落及多樣性與土壤因子的關系

山地森林生態系統中,海拔的變化會導致溫度、降水等氣候因子的急劇變化[8],而微生物對環境變化極為敏感,研究發現SOC、TN與微生物群落及多樣性正相關,pH、BD與微生物群落及多樣性負相關,這與谷曉楠等[35,37]研究結果相似,森林生態系統中土壤有機碳與土壤全氮關系密切,同時土壤C、N為微生物提供能源,促進植物對養分的吸收利用。Tan等[40]和Lauber等[41]研究發現土壤全磷含量的變化會影響土壤細菌及真菌群落的多樣性。也有研究表明[42],植被類型、凋落物性質、土壤物理性質等對土壤微生物群落結構及多樣性有顯著影響。由此可見,一定區域土壤微生物群落結構及多樣性受多因素綜合影響[43]。

4 結論

采用磷酸脂肪酸(PLFA)法定量分析賀蘭山自然保護區東坡不同海拔植被帶土壤微生物PLFA的種類和含量。YS植被帶土壤微生物PLFA的總量以及特征微生物的含量最大,表明賀蘭山自然保護區東坡在YS植被帶具有更適合微生物生存的環境,這也符合山地生態系統中中部區域生物多樣性高的理論。

研究自然保護區東坡不同海拔植被帶土壤微生物多樣性發現不同植被帶土壤PLFA生物標記聚類不同,16:0、18:1ω9c和18:1ω7c基本在每個植被帶都會單獨聚為一類,可知其在該植被帶含量高且有獨特作用。多樣性指數顯示HJ植被帶土壤微生物多樣性更高,說明植物多樣性與土壤微生物多樣性密切相關。可見不同海拔植被帶土壤微生物群落結構及多樣性存在差異,可為賀蘭山東坡自然保護區的高質量管理提供理論依據。