實驗動物小腸結腸炎耶爾森菌的實驗室檢測能力驗證結果評價*

馮育芳 邢 進 王 洪 張雪青 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院 實驗動物資源研究所，北京 100050)

小腸結腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)可產生耐熱腸毒素，不能被高溫滅菌(121 ℃、30 min)破壞，對酸堿穩定。食用被該菌污染的食物、水，以及與感染動物接觸，可導致人獸共患病，甚至造成死亡[1-2]。因此，小腸結腸炎耶爾森菌屬于SPF級動物必要時檢測項目[3]。為了解和提高實驗動物小腸結腸炎耶爾森菌的檢測能力，本次能力驗證項目依據CNAS-CL03《能力驗證提供者認可準則》進行檢測能力驗證(NIFDC-PT-173)，以期對提升實驗動物小腸結腸炎耶爾森菌的檢測能力[4]提供參考，同時對實驗動物微生物檢測能力驗證計劃的實施提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：SPF級雌性豚鼠2只，8周齡，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所提供【SYXK(京)2017-0012】，實驗動物福利倫理號：中檢動(福)第2021(A)007號。動物糞便采集在生物安全柜內進行。

1.1.2菌株：本研究使用小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica, CMCC52301)，同時設置2個干擾菌；根據細菌形態和特征，選擇宋內志賀氏菌(Shigellasonnei, CMCC51082)和大腸埃希氏菌(Escherichiacoli, CMCC44110)。3株菌均購自中國食品藥品檢定研究院中國醫學細菌保藏管理中心，使用前通過BD-Phoniex100細菌鑒定儀進行鑒定。

1.1.3試劑材料：凍干保護液由中國食品藥品檢定研究院食品化妝品所提供。培養基包括哥倫比亞血瓊脂基礎(OXIOD公司，CM0331B)、脫纖維羊血(北京陸橋公司，P62)、CIN-1培養基(海博生物，HB0269)和改良Y培養基(海博生物，HB0270)；生化鑒定試劑為BD陰性菌鑒定板(BD公司，448007)。

1.2 方法

1.2.1質控樣品制備：復蘇小腸結腸炎耶爾森菌、宋內志賀氏菌和大腸桿菌，在哥倫比亞血瓊脂培養基進行傳代，25 ℃培養48 h后分別用PBS調成109CFU/mL的菌懸液備用。將80%的凍干保護液、10%的SPF豚鼠糞便(高壓滅菌后)和10%的菌懸液(109CFU/mL)震蕩混勻制成混懸液，細菌終濃度為108CFU/mL，將3種混懸液進行分裝(200 μL/管)，用冷凍干燥機制成凍干樣品。樣品采用大流水方式進行編號。

1.2.2質控樣品均勻性試驗：在3種樣品中分別隨機抽取10管樣品，用200 μL滅菌水重懸，10倍系列稀釋至102CFU/mL，將102～104CFU/mL濃度的菌液接種改良Y瓊脂，25 ℃培養48 h后進行菌落計數，菌液濃度相差應低于100倍，即原始菌液濃度應在106～108CFU/mL之間。

1.2.3質控樣品穩定性試驗：本次能力驗證的3種質控樣品進行穩定性檢驗，首先對貯藏穩定性進行檢驗，于-20 ℃、4℃、25 ℃、37 ℃保存。-20 ℃于0 、30 d時取樣，4 ℃于0、14、21、28 d取樣(25±1)℃、37 ℃于0～10 d每天取樣，參照作業指導書對上述抽取樣品進行檢驗。用200 μL滅菌水重懸將菌液接種改良Y瓊脂，25 ℃培養48 h，3種樣品可分別檢測出相應的細菌。同時對運輸穩定性進行檢驗，選取不同溫度條件的城市，將樣品完全按照實際運輸要求進行包裝，分別寄往相應城市后再寄回，應能檢出相應細菌。

1.2.4參加實驗室：全國共24家實驗室參加了此次能力驗證計劃，地區分布見表1。

表1 參加實驗室地區分布Table 1 Local distribution of Laboratory

1.2.5檢測方法：本次能力驗證建議參考GB/T 14926.3—2001實驗動物耶爾森菌檢測方法。不局限于國標規定檢測方法，但要求提供原始記錄，并要求含有具體檢測信息。

1.2.6結果判定標準：3種樣品中1個為小腸結腸炎耶爾森菌陽性，2個為小腸結腸炎耶爾森菌陰性。實驗室結果與上述結果完全一致，即判定為滿意結果；實驗室結果與上述結果不一致，即判定為不滿意結果；未按時反饋結果，也判定為不滿意結果。

2 結果

2.1 質控樣品均勻性試驗

隨機選取10套樣品用于均勻性驗證，所有樣品在相同環境下對所含細菌數量進行平板計數測定。3種樣品測定結果為：CMCC52301濃度 8.99×107～3.48×108CFU/mL，CMCC51082濃度 9.20×107～3.98×108CFU/mL。CMCC44110濃度 7.65×107～2.98×108CFU/mL。表明本次能力驗證所制備的樣品是均勻的。

2.2 質控樣品穩定性試驗

按照1.2.3的方法對所制備的能力驗證樣品進行溫度和運輸穩定性測試，4 ℃存儲4周，室溫(25±1)℃和37 ℃放置10 d，3種樣品均能檢出相應細菌。運輸穩定性檢驗證實樣品可以滿足運輸要求，并保持細菌活性。存放穩定性和運輸穩定性結果證明了所制備能力驗證樣品的穩定性達到發放要求。

2.3 實驗室反饋

參加此次比對共24個實驗室，22家滿意，占實驗室總數的91.7%；2家不滿意，占實驗室總數的8.3%，其中1家未及時反饋結果，另一家將小腸結腸炎耶爾森菌陰性樣品檢測為陽性。本次能力驗證不公布具體實驗室名稱，僅以實驗室代碼進行統計，具體結果見表2。

表2 實驗動物小腸結腸炎耶爾森菌檢出能力驗證結果匯總Table 2 The summarizing of the detection levels of experimental animal Yersiniaenterocolitica testing results

3 討論

CNAS-RL01: 2018《實驗室認可規則》、CNAS-RL02: 2018《能力驗證規則》規定申請認可和獲準認可的實驗室必須通過參加能力驗證活動(包括CNAS組織實施或承認的能力驗證計劃、測量審核)證明其技術能力。只有在能力驗證活動中表現滿意，或對于不滿意結果能證明已開展了有效糾正措施的實驗室，CNAS方可受理認可申請或予以認可。對參加了CNAS組織及其承認的能力驗證活動且有穩定滿意表現的實驗室，在CNAS的各類評審中可考慮適當簡化相關項目的能力確認過程。實驗室應保存上述記錄以備評審組檢查。

能力驗證是實驗室檢測質量監控的重要手段，既是實驗室內部質量控制的補充，又是政府和社會了解實驗室檢測能力的重要方法[5]。能力驗證作為日常監督檢查的輔助手段，能夠有效提升實驗室的檢測能力。促進實驗室保持有效的檢測能力，同時也幫助部分實驗室及時發現自身的不足并加以改進，為更好地檢測實驗動物提供有力的技術支撐[6-7]。本項目研究，包括小腸結腸炎耶爾森菌能力驗證樣品的制備、評價方案的制定以及能力驗證結果的匯總分析，評價參加單位實驗動物致病菌的檢測能力，驗證計劃的組織和實施工作。

根據實驗動物國家標準，小腸結腸炎耶爾森菌的檢測程序為：無菌操作下取回盲部內容物、糞便或肛拭子，接種于CIN-1或改良Y瓊脂平皿，置25 ℃培養48 h，觀察平皿上是否有邊緣半透明或透明，中心呈深紅色，表面濕潤突起的“牛眼狀”菌落，如有可疑菌落，需要純培養后進行生化鑒定，生化鑒定可以選擇全自動細菌鑒定儀，也可以選擇生化條，或者根據國標中的生化項目進行檢測均可以得出準確的結論。

從NIFDC-PT-173實驗動物腸道中小腸結腸炎耶爾森菌檢測能力驗證計劃結果報告中可以看出，本次能力驗證計劃參加實驗室共有24家，其中23家實驗室在規定時間內提交了結果反饋單，1家沒有及時提交結果反饋單。其中判定為滿意結果的有22家，占91.7%，不滿意結果有2家，占8.3%。實驗動物質量檢測機構對小腸結腸炎耶爾森菌的檢測能力很高。本次能力驗證不規定檢測方法，參加單位中有6家采用了不止2種檢測方法，有2家單位使用了PCR方法進行檢測并準確的檢測出小腸結腸炎耶爾森菌，20家均采用了生化鑒定法，實驗室449未及時反饋結果，判為不滿意，實驗室887將陰性樣本檢測為陽性，判為不滿意，查驗了該單位的檢測報告，考慮可能是因為初次接種樣本時污染或接錯等導致鑒定結果不準確。

本次能力驗證活動采用生化鑒定的單位中有9家沒有生化管來源及批號信息，要求檢測報告中應含有完整的試劑信息。在參加單位中，有2家單位寄回的紙質材料中沒有原始記錄，所以無法判斷這2家單位用的何種檢測方法。除去能力驗證的要求，附原始記錄對參加單位是有好處的，比如結論填報錯誤但原始記錄結果正確，這種情況會聯系該單位要求其改正結論，如果沒有原始記錄即只能判定該單位結果不滿意。

綜上所述，本次能力驗證的實施有助于實驗動物質量檢測實驗室在小腸結腸炎耶爾森菌檢測過程中發現自身的問題，并且針對性的予以解決，達到提高自身檢測能力的目的，最終提升實驗動物質量水平，保障實驗動物和動物實驗的安全和效果。