基于網絡藥理學探討侗藥血水草活性成分抗腫瘤的作用機制*

梁 沛 胡芷茵 楊翠玉 周小強 周永濤 周 群

湖南醫藥學院，湖南省懷化市 418000

腫瘤被認為是全世界的醫學難題之一，一直以來腫瘤疾病對人類的身心健康造成著嚴重的危害。腫瘤疾病有著發病機制復雜、治療效果差及復發轉移率高等一系列問題。由世衛組織公布的全球癌癥報告數據顯示，全球癌癥患者和死亡病例每年都在呈上升趨勢，腫瘤疾病被認為是人類死亡的重要因素之一[1]。一直以來天然產物在抗腫瘤方面具有一定的潛力與優勢[2]，隨著中醫藥在臨床實踐的應用，其在治療腫瘤疾病方面取得的作用不斷突顯。血水草(Eomecn chionantha Hance)為罌粟科多年生草本植物，侗藥地方名為娘嫩帕(Nyangt naemx padt)主要分布于湖南、廣西、貴州交界的山區地帶，是侗族地區特有的藥用植物，侗藥血水草常生于溝邊或低平濕地，其形態為多年生草本，含紅黃色汁液，根狀莖橫生，葉基生，具長柄；葉片卵狀心形；花瓣4個，白色；果實為朔果，種子多數。侗族人常用于跌打損傷、毒蛇咬傷、便血痢疾等疾病的治療。現代研究表明，血水草活性成分主要為生物堿類，包括血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿等活性成分[3-4]，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用。目前侗藥血水草在抗腫瘤方面的研究不多，作用機制尚不明確。本研究主要基于網絡藥理學的方法，挖掘與預測侗藥血水草活性成分與抗腫瘤靶點之間的聯系，構建藥物成分—關鍵靶點—通路之間的相互作用網絡，揭示侗藥血水草抗腫瘤的作用機制，從而為侗藥血水草在治療腫瘤疾病方面提供新的研究思路及依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫及軟件 TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)；PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)； SwissTargetPrediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)；GeneCards 數據庫(https：//www.genecards.org/)和Draw Venny Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)； STRING(https://string-db.org/)；生物信息注釋數據庫(DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/)；軟件：Cytoscape3.7.1和R語言。

1.2 活性成分、藥物及腫瘤相關基因的篩選 TCMSP數據庫根據口服生物利用度(OB)≥25%、類藥性(DL)≥0.18的標準驗證前期從侗藥血水草中分離得到的生物堿類化合物是否具有藥效活性。利用PubChem 數據庫在搜索框內分別輸入4種化合物的英文名稱，獲得4種化合物的化學結構式和canonical SMILES 結構式輸入 SwissTargetPrediction 平臺預測化合物的相關基因。以 “tumour”為關鍵詞在GeneCards 數據庫中搜索腫瘤相關靶點基因。使用Venny2.1.0軟件獲取兩者的交集靶點基因，即為化合物作用于腫瘤的交集靶點基因。

1.3 PPI網絡構建及Hub基因篩選 運用 STRING數據庫，選用 Multiple proteins工具，限定物種為人，獲取化合物與疾病的交集靶點基因的蛋白互作網絡(PPI)，將其保存為TSV 格式文件。應用Cytoscape3.7.1軟件對TSV格式文件內容進行可視化的分析，且通過“Network tools”進行網絡拓撲參數分析，以節點BetweennessCentrality，ClosenessCentrality，degree 值均大于三者中位數作為Hub基因的篩選標準， Cytoscape3.7.1軟件構建“藥物成分—關鍵靶點—疾病”三者的相互關系網絡。

1.4 GO生物功能和KEGG通路富集分析 使用DAVID6.8數據庫對Hub基因進行GO生物功能 和 KEGG 通路富集分析，以P<0.05 為篩選條件。 在DAVID的Functional Annotation模塊進行富集分析。選擇物種參數為homo sapiens，標識符參數為official gene symbol，列表類型參數為gene list，其余參數為默認值。獲得生物過程(BP)分子功能(MF)和細胞組分(CC)的富集結果。同時KEGG通路富集分析，得到藥物治療腫瘤的顯著富集信號通路。

2 結果

2.1 活性成分及靶點預測前期通過分離侗藥血水草得到了的4個生物堿類活性成分血根堿、原阿片堿、別隱品堿、白屈菜紅堿，在TCSMP數據庫中進行藥效活性篩選，結果為這4個化合物都符合要求(表1)。藥物靶點預測數據庫獲得4個活性成分的靶點共計239個，疾病靶點預測數據庫獲得腫瘤對應的靶點為9 910個，兩者取交集得到199個交集基因(見圖1)。

表1 活性成分參數列表

圖1 化合物與腫瘤靶點的venn圖

2.2 PPI網絡構建及hub基因 將交集靶點導入STRING數據庫中得到PPI網絡，其中相關節點有PTGS2、PTGS1、BTK、SIRT1、BCL2、MTOR、MAPK8、CHEK1、AR、HCRTR2、DRD2、AGTR1等，并對其進行網絡分析，篩選得到Betweenness Centrality(0.002 1)，ClosenessCentrality(0.442 4)，degree(15)3個拓撲參數均大于所有節點中位數的靶點共計66個，即為網絡的Hub節點(關鍵基因)，其中主要的節點有HSPOAA1、MAPK1、MTOR、SRC、PIK3CA、SIRT1、PTGS2、CSNK2A1、SLC9A1、TYMS，這些基因可能是對腫瘤起主要治療作用的靶點(Degree值排名前十的靶點，如表2所示)。然后將篩選后得到的靶點利用Cytoscape 3.7.1 軟件，構建血水草活性成分治療腫瘤“成分—靶點—疾病”網絡圖，并進行可視化分析，結果反映血水草活性成分對腫瘤的治療作用與HSP90AA1等基因密切相關。

表2 4種藥物與腫瘤核心靶點的相關拓撲參數

2.3 GO生物功能富集分析 DAVID 數據庫進行 GO 生物功能富集分析，共獲得323個富集結果，利用R語言對富集結果排名前十的功能進行了可視化編輯(見圖2)，其中生物過程(BP) 主要包括pro-tein phosphorylation，peptidyl-serine phosphorylation，response to drug，protein autophosphorylation等；細胞組分(CC) 主要包括cytosol，plasma membrane，mitochondrion，phosphatidylinositol 3-kinase complex等；分子功能(MF)主要包括protein binding,ATP binding，protein kinase activity，kinase activity，protein serine/threonine kinase activity等。

2.4 KEGG 通路富集分析 運用DAVID 數據庫進行了KEGG通路富集分析，結果共獲得了92條信號通路，利用R語言對這些通路富集的結果進行了可視化展示，這些通路主要涉及Pathways in cancer(癌癥通路)、Proteoglycans in cancer(癌癥中的蛋白多糖)、Neurotrophin signaling pathway(神經營養因子信號通路)、Prostate cancer(前列腺癌)等，這可能是血水草生物堿類活性成分參與發揮抗腫瘤作用的主要調控途徑(見圖3)。

3 討論

Hopkin首次提出了網絡藥理學的概念，開啟了一種全新的研究模式。網絡藥理學是融合生物學的研究方法，借助信息網絡學、藥理學、統計學等學科，構建藥物—成分—靶點—疾病之間的相互關系，闡明并詮釋藥物多成分與疾病之間的網絡關系，打開了藥物與疾病研究模式的新視角[5-6]。網絡藥理學系統整體地揭示藥物與靶蛋白作用對疾病的影響，成為發展創新藥物的重要途徑，具有重要的理論和實際應用價值。近年來網絡藥理學被應用于多種領域，尤其在中醫藥研究中的應用日漸凸顯，在治療腫瘤疾病的研究中也取得了廣泛進展，突出了在分子層面闡明多靶點、多通路的特點[7]。中藥單體在腫瘤藥物方面的研發越來越受到重視，以網絡藥理學為契機開拓一條中藥單體與疾病之間機制研究的新路徑。

目前對血水草的研究發現生物堿類活性成分具有抗腫瘤活性，但具體機制還有待進一步闡明。本研究分析發現侗藥血水草生物堿類活性成分發揮抗腫瘤作用的信號通路主要集中在癌癥通路、癌癥中的蛋白多糖、神經營養因子信號通路等，這些途徑與腫瘤的發生發展直接有關。有研究報道血根堿對腫瘤細胞具有抗炎、抗氧化、促進凋亡及抑制生長的作用[8]。血根堿通過調控MMP-2、MMP-9、cyclinD、CDK4蛋白的表達，抑制胃癌細胞的增殖，降低細胞的遷移[9]，還能經MAPK/JNK途徑抑制胃癌細胞增殖[10]。血根堿參與調控乳腺癌缺氧誘導通路，通過抑制MAPK/ERK/HIF-1α通路的激活抑制腫瘤的生長[11]。血根堿還能通過PI3K/AKT/MTOR通路抑制卵巢癌的發生[12]。原阿片堿在抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤細胞凋亡方面表現出一定的優勢，原阿片堿分別可以通過激活線粒體凋亡通路[13]及P53途徑[14]，抑制PI3K/AKT通路[15]參與抗腫瘤細胞的生長。有報道稱白屈菜紅堿通過調節MMP/TIMP系統抑制NF-κB通路從而抑制人前列腺癌細胞的增殖和轉移[16]，且鹽酸白屈菜紅堿通過PI3K/AKT/MTOR/BAD信號通路引發線粒體凋亡達到抑制HeLa 細胞增殖的作用[17]。目前別隱品堿抗腫瘤的研究國內外文獻報道甚少，可在網絡藥理學分析的基礎上進一步展開新的研究。由此可見血水草生物堿類活性成分在抑制腫瘤細胞的生長、遷移方面主要與MAPK、PI3K通路、線粒體凋亡通路有著密切的聯系，也是目前研究較多的方向。

另外，本研究對血水草活性成分進行檢索分析，運用網絡藥理學方法共收集到活性成分的靶點239個；疾病靶點9 910個；藥物成分和疾病的交集靶點199個，活性成分和腫瘤的關鍵核心靶點有HSP90AA1、MAPK1、MTOR、APP等。其中有研究指出HSP90AA1可作為預測癌癥發生和轉移風險的指標[18]，提示HSP90AA1是在腫瘤發生過程起著重要的作用。APP 在癌細胞中過表達，與DR6結合可啟動壞死凋亡途徑導致腫瘤細胞外滲和轉移[19]。MAPK1和MTOR可調節細胞的生長、存活、代謝、分化、蛋白質合成等多種生物學過程，在癌癥的發生發展中起到了關鍵作用[20-22]，有研究已經證實血水草生物堿類活性成分通過調控MAPK、MTOR抑制腫瘤細胞的生長。但是目前血水草生物堿類活性成分通過調控HSP90AA1、APP參與癌癥發生的相關研究還較少，我們可以通過對關鍵核心靶點進行深入研究，進一步探索在抗腫瘤方面的機制與作用。

通過對侗藥血水草抗腫瘤作用的網絡藥理學研究分析發現，血水草生物堿類活性成分通過多靶點、多通路發揮抗腫瘤的作用，為下一步實驗驗證血水草活性成分抗腫瘤作用機制提供科學理論依據與新思路，同時為民族藥的藥理機制研究提供新的方向。