基于網絡藥理學和分子對接技術探討驅痛散治療急性腰扭傷的作用機制

王 君

(河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000)

急性腰扭傷(acute lumer sprain,ALS)是指腰肌、筋膜、韌帶等軟組織因外力作用突然受到過度牽拉而引起的急性撕裂傷,主要由過度負荷、姿勢不當或運動前準備不足而致腰痛和腰部活動受限。據統計，60%～80%成年人，特別是青年、中年人和體力勞動者會發生急性腰扭傷，嚴重影響人們日常生活[1]。目前，西醫有兩種治療方法。一種是抗炎解熱藥，通過阻斷細胞周期、抑制前列腺素的合成來緩解疼痛；一種為封閉治療，作用時間較短[1]。故目前諸多研究旨在尋求替代療法。既往研究證實，中醫藥治療ALS具有良好效果[2]。雖然驅痛散對ALS有較好效果，但由于其多成分、多靶點的特征，傳統的研究分析方法很難系統地闡明其整體作用特點，網絡藥理學的出現為研究中藥復方提供了新的方向[3]。筆者基于網絡藥理學方法挖掘現有數據庫對驅痛散的有效成分進行篩選，采用分子對接法驗證篩選出的核心活性成分和核心蛋白相互作用強度，對驅痛散作用于ALS的機制進行探討，為進一步研究驅痛散治療ALS提供科學依據。

1 靶點數據集的建立

本研究借助中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)檢索出澤蘭、木瓜、薄荷、側柏葉、延胡索、大黃、黃柏、青黛、三七、小茴香的活性成分和作用靶點信息。使用人類基因數據庫(GeneCards)篩選ALS的靶點數據集，上傳至在線韋恩圖獲取上述藥物的活性化合物和其相關疾病的韋恩圖和交集基因。

2 網絡的構建與分析

通過 Cytoscape 3.7.2 軟件構建“活性化合物-靶點基因”相互作用關系的網絡圖。基于網絡中節點拓撲結構特征值篩選主要活性成分及主要作用的靶點基因。

3 蛋白互作網絡的構建與分析

在String數據庫(https://string-db.org/Version 10.5)內輸入“藥物-疾病”相同靶點基因，設置相應蛋白關系評分從而得到PPI網絡。

4 通路富集分析

利用 Cytoscape 3. 7. 1 軟件里的CluoGO插件，選擇P< 0.01的通路和生物過程，進行藥物活性成分發揮作用的生物過程和調控通路富集分析。

5 分子對接

采用分子對接法驗證所篩選出的核心活性成分和核心蛋白相互作用強度。活性成分結構、蛋白質結構所得分別通過有機小分子生物活性數據庫(PubChem)、蛋白質結構數據庫 (PDB)。分子對接軟件為 AutoDock Vina ，并用 Pymol 軟件進行優化。

6 結 果

6.1 中藥復方的活性成分及相應靶蛋白

依據TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，設置口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18進行篩選。得到中藥復方藥物活性成分145種，其中澤蘭2種，木瓜4種，薄荷10種，側柏葉7種，延胡索49種，大黃16種，黃柏37種，青黛9種，三七8種，小茴香3種。

6.2 活性成分及靶點的獲取

分別將藥物活性化合物及對應靶點，疾病的相關基因靶點上傳至在線韋恩圖，獲得230個共性靶點。見圖1。

圖1 共同靶點韋恩圖

6.3 中藥復方調控網絡的構建及 CytoNAC 網絡拓撲分析

將獲取的ALS相關靶點和驅痛散靶點進行匹配，獲得驅痛散治療ALS的潛在基因231個。 采用Cytoscape軟件進行驅痛散調控ALS網絡構建。見圖2。

圖2 成分-靶點網絡圖

6.4 蛋白質相互作用網絡構建

使用 String 數據庫獲取中藥復方治療 ALS 相關靶標的相互作用關系，導入 String 數據庫，構建PPI 網絡圖并進行分析。結果發現,共有230個節點，4 141條線，平均節點度值為36。見圖3。進一步借助 Cytoscape 3.7.2 軟件對PPI網絡數據進行拓撲分析，最終得出RELA、CXC趨化因子配體8(CXCL8)、絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)8成分與靶點的關聯數量較多，可能是驅痛散治療ALS的潛在診療靶點。見圖4。

圖3 PPI 互作網絡圖

圖4 核心靶蛋白基因篩選路徑(集群1～6)

6.5 GO 生物學功能分析

將230個潛在靶點映射到 DAVID 數據庫中進行生物過程(BP)、細胞組成(CC)、分子功能(MF)分析，共得到BP 682個，CC 73個 ，MF 139個。篩選BP、CC、MF中P值最小的前 20個生物學功能并繪制其條形圖。生物過程主要包括：藥物反應(response to drug)、乙醇應答(response to ethanol)、RNA聚合酶轉錄正反饋(transcription from RNA polymerase II)、啟動子(promoter)、脂多糖應答(response to lipopolysaccharide)、衰老(aging)等。細胞組成主要包括：細胞外隙(extracellular space)、細胞質(cytosol)、軸突末端(axon terminus)、膜筏(membrane raft)、膜小凹(caveola)等。分子功能主要包括：酶結合(enzyme binding)、蛋白結合(protein binding)、蛋白酶同源二聚體(protein homodimerization activity)、同蛋白結合(identical protein binding)、蛋白質同源二聚體(protein heterodimerization activity)等。見圖5～7。

圖5 驅痛散主要作用靶點 BP 條形圖

圖6 驅痛散主要作用靶點 CC 條形圖

圖7 驅痛散主要作用靶點 MF 條形圖

6.6 KEGG 通路分析

運用R語言對所有靶點進行 KEGG 通路富集分析，共篩選出131條相關通路，對P值最小的 20 條通路繪制相關條形圖，見圖8 。KEGG富集分析所涉及的通路包括乙型肝炎(Hsa05161:hepatitis B)、癌癥(Hsa05200:pathways in cancer)、膀胱癌(Hsa05219:bladder cancer)、TNF(Hsa04668: TNF signaling pathway)、PI3K-AKT(Hsao04151:PI3K-AKT signaling pathway)、Toll(Hsa04620:Toll-like receptor signaling pathway)、缺氧誘導因子-1(HIF-1)(Hsa04066:HIF-1 signaling pathway)、FOXO(Hsa04068:FOXO signaling pathway)等。

圖8 驅痛散主要作用靶點 KEGG 富集氣泡圖

6.7 較優活性成分與核心靶點對接結果

對圖 4 藥物-活性成分-靶點-疾病網絡圖進行拓撲網絡數據分析，得出核心活性成分為β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素，核心靶點為RELA、CXCL8、MAPK8、白細胞介素(IL)-6等。對排前3名的受體蛋白RELA、CXCL8、MAPK8(圖4集群6顯示)進行分子對接。在AutoDock Vina 1.1.2軟件中將各個配體小分子與受體蛋白逐個對接，結合能及對接參數如表1所示。結合能越小說明結合活性越強烈，當≤-5.0 kcal/mol 時顯示分子對接有潛在研究意義，結合能≤-7.0 kcal/mol 說明受體與小分子之間對接效果極佳[4]。核心成分與β-谷甾醇、豆甾醇槲皮素的結合能數值顯示本次對接有研究意義,見表1。將RELA、CXCL8、MAPK8與β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素對接在Pymol軟件中構圖，見圖9。

表1 活性成分與核心靶點對接值

圖9 活性成分與核心靶點對接圖

7 討 論

《諸病源候論》曰：“勞損于腎，動傷經絡……風冷、血氣互搏，發為腰痛。”故中醫藥治療ALS原則為祛瘀活血、通絡止痛。驅痛散為臨床經驗方。方中澤蘭、延胡索活血散瘀，理氣止痛；三七止血散瘀、消腫止痛；木瓜、薄荷舒筋活絡，行氣通絡；小茴香性溫，味辛而甘，行氣止痛；側柏葉止血；青黛、黃柏、大黃清熱解毒止痛。諸藥合用，共奏祛瘀通絡、活血止痛之功。

驅痛散中主要活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等。甾醇被稱為“生命的鑰匙”，其中β-谷甾醇和豆甾醇最為常見，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[4-5]。研究[6]發現，β-谷甾醇通過抑制核轉錄因子(NF-κB)的磷酸化從而抑制實驗性結腸炎小鼠腸組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的炎癥表達，并呈濃度依賴性。另有研究[7]發現，β-谷甾醇通過抑制NF-κB、激活核因子E2相關因子(Nrf-2)/血紅素加氧酶-1(HO-1)通路發揮其抗炎的作用。有學者[8]在探討豆甾醇對腦缺血再灌注(I/R)損傷大鼠腦組織炎癥因子、抗氧化能力和凋亡信號通路的影響時發現，豆甾醇組一氧化碳和丙二醛水平顯著低于I/R組，環氧化酶-2 (COX-2)和NF-κB p65表達也顯著低于I/R組；Nrf2和HO-1表達顯著增加，抗氧化酶和超氧化物歧化酶活性升高；豆甾醇能下調細胞凋亡因子(Bax)和裂解半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)的表達。研究[9]證實，豆甾醇通過抑制IL-1β調控NF-κB 通路，進而抑制炎癥介質和基質降解，減緩關節炎癥引起的軟骨退化。槲皮素作為一種可治療與關節炎相關的疼痛和炎癥的天然化合物，具有免疫調節、抗氧化、抑制MAPKs生成、抑制炎癥介質的表達和分泌，以及抑制滑膜細胞增生等多種生物活性[10]。有研究采用槲皮素治療Ⅱ型膠原免疫性關節炎小鼠，結果血漿中炎癥相關因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、基質金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-9及C反應蛋白均顯著降低，足部TNF-α、CCL2、MMP-3 和 MMP-9 表達也明顯降低[11]。槲皮素對炎癥過程的調節作用涉及多種信號途徑，包括PI3K、MAPK、細胞外信號調節激酶(ERK)等[12]；其還可能通過改變PI3K與ATP結合，激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，使激活的AMPK抑制PI3K的活性，從而觸發抗腫瘤和抗炎反應[13-14]。

CXCL8是由不同類型細胞分泌的一種促炎趨化因子，其表達受多種細胞因子(IL-1、IL-6、CXCL12、TNF-α)、缺氧、活性氧(ROS)、細菌顆粒等的刺激，并由轉錄因子NF-κB和激活蛋白-1 (AP-1)介導[15-16]。研究發現，CXCL8-CXCR1/2軸保護宿主免受進一步感染和組織損傷的機制是CXCL8-CXCR1/2在感染部位吸收中性粒細胞，誘導中性粒細胞氧化爆發，釋放顆粒，消除炎癥刺激，提高細菌清除率[17-18]。MMPs以無活性酶原的形式存在于正常的椎間盤組織內，MMPs參與關節軟骨細胞外基質分解，同時作用于其他細胞因子，一定程度加快炎性細胞因子的分泌[19]。有學者[20]在豆甾醇對兔關節炎模型軟骨降解作用機制的研究中發現，與正常組相比，軟骨關節炎組MMPs較高，基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)明顯降低，豆甾醇通過抑制 MMPs 表達減緩軟骨降解。RELA作為典型炎癥信號通路NF-κB中一員，通過調控NF-κB的轉錄活性，發揮其抗炎作用[21]。

GO富集分析結果顯示，富集的生物過程主要包括細胞凋亡、細胞膜轉運、氧化應激和細胞對非生物刺激的反應等。KEGG富集分析所涉及的通路包括TNF、PI3K-AKT、Toll、HIF-1、小細胞肺癌、乙型肝炎、膀胱癌、胰腺癌等信號通路。PI3K-AKT作為細胞內信號轉導經典通路，廣泛存在于類風濕關節炎(RA)滑膜組織中，在其被異常激活時可通過調控細胞生長、增殖、分化、凋亡來影響疾病的發病進程[22-23]；此外，該信號通路對脂多糖誘導的急性炎癥反應具有負調節作用[24]。有學者[25]將重組腺病毒(Adspry2)作用于成纖維樣滑膜細胞(FLS)，發現Adspry2作用的 FLS 的炎癥因子表達水平較編碼綠色熒光蛋白(ADGFP)的腺病毒載體組和未作用ADGFP組明顯降低，Sprouty(SPRY2)可以通過調節PI3K/AKT及ERK信號通路有效地降低RA-FLS細胞中炎癥介質的產生，同時抑制FLS的過度增殖，發揮治療RA的作用。本研究通過網絡藥理學推測，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇可能通過抑制CXCL8、MPKA8、RELA及調控PI3K、Toll、HIF-1、TNF通路，調整下游蛋白，降低細胞凋亡，從而觸發抗炎反應，發揮治療作用。此為臨床推廣應用驅痛散提供了依據。

綜上所述，驅痛散可能通過其主要成分槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等作用于關鍵靶點CXCL8、MPKA8、RELA，發揮對PI3K-AKT、TNF、Toll、FoxO信號通路的調控作用從而干預細胞凋亡和增殖、抑制炎癥反應來治療急性腰扭傷。此以中醫整體觀念為指導思想，基于復方治療疾病多成分-多靶點-多途徑的特點，為臨床診療ALS提供新的思路。本研究在數據庫完整性、篩選策略、炮制對藥性改變等方面仍存在很多不足之處，因此還需臨床及體內外實驗進一步驗證。