五行香草軟膏的多指標成分含量測定*

閆紅敏，于蘭蘭，郭子燕，張 瑋

(1.河南省直第三人民醫院， 河南 鄭州 450006； 2.河南中醫藥大學第二臨床醫學院，河南 鄭州 450002； 3.河南省中醫藥研究院附屬醫院， 河南 鄭州 450004)

五行香草方由白芷、川芎、藁本、防風、細辛5味中藥組成，是河南省直第三人民醫院在臨床實踐中總結的純中藥外用方，可作用于足底特殊穴位，對腳氣、腳臭、骨刺等有顯著的治療作用[1]。方中白芷祛風濕止癢[2]，可潤澤皮膚而治療皮膚疾患[3-4]；川芎活血祛風[5]，外用有抑菌和體外促透作用[6]；藁本祛風散寒止痛，其水煎劑對皮膚癬菌有抑制作用[7]；防風祛風止痙[8]，外用具有抑菌作用[9-10]；細辛祛風止痛[11]，其所含的揮發油為廣譜抗真菌藥物，其中細辛揮發油中黃樟醚為抗真菌主要有效成分[12-14]。本研究在五行香草處方的基礎上，應用現代制藥技術[15-16]制備五行香草軟膏，建立五行香草軟膏的多指標成分含量測定方法，為五行香草軟膏的質量研究提供相關參考依據。

1 藥品、試劑與儀器

白芷(批號B712191-01)、川芎(批號B810103-01)、防風(批號B710304-01)，均購自河北楚風中藥飲片有限公司；細辛，購自湖北聚瑞中藥飲片有限公司，批號170701；藁本，購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，批號1707005。所有藥材均由河南中醫藥大學第三附屬醫院劉秋艷主任藥師鑒定，符合《中國藥典》2020版一部各品種項下規定[17]。細辛脂素，中國食品藥品檢定研究院產品，批號111889-201504；升麻素苷(批號Y31M9H62747)、阿魏酸(批號H25M6L1)、歐前胡素(批號P02J9F64791)，均為上海源葉生物科技有限公司產品；乙酸乙酯、正丁醇、磷酸二氫鉀、甲醇均為分析純，為天津市永大化學有限公司產品；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純，為西格瑪試劑有限公司產品。BSA224S-CW電子天平，德國賽多利斯公司產品；Waters e2695高效液相色譜儀，美國沃特世有限公司產品；85-2A雙數顯恒溫磁力攪拌器，金壇區西城新瑞儀器廠產品；HK250科導臺式超聲波清洗儀器，上海漢克科學儀器有限公司產品。

2 方法與結果

2.1 五行香草軟膏的制備

2.1.1 處方及基質的選取

五行香草軟膏由白芷、防風、細辛、川芎、藁本5味中藥組成。根據文獻[18-19]及預實驗結果，選擇O/W型基質，五行香草軟膏的乳化工藝為溫度68 ℃、轉速500 r/min、乳化時間45 min。

2.2 建立定量測定方法

2.2.1 制備供試品溶液

精密稱取5 g樣品，放入具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，超聲提取30 min，進行兩次上述操作并過濾，合并濾液并蒸干；加入氨水20 mL溶解殘渣，用乙酸乙酯萃取2次，每次30 mL；棄去乙酸乙酯層，水層用水飽和正丁醇萃取3次，每次30 mL；合并正丁醇液，蒸干；殘渣加入甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻并過濾，取續濾液，即得。

2.2.2 制備對照品溶液

分別取歐前胡素、阿魏酸、升麻素苷、細辛脂素對照品適量，用甲醇溶解制成含歐前胡素43.8 mg/L、阿魏酸63.4 mg/L、升麻素苷51.9 mg/L、細辛脂素53.8 mg/L的混合對照品溶液。

2.2.3 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-5.0 mmoL/L KH2PO4溶液(B)(以稀H3PO4調節pH值至3.0)；梯度洗脫為0-5 min,15%A;5-30 min,5%A～80%A; 30-32 min,80%A～15%A，32-40 min,15%A；流速1.0 mL/min，檢測波長287 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。上述色譜條件下，混合對照品、五行香草軟膏及陰性樣品的色譜圖見圖1。

1.升麻素苷; 2.阿魏酸;3.歐前胡素;4.細辛脂素A.混合對照品；B.供試品；C.缺防風陰性樣品；D.缺川芎、藁本陰性樣品；E.缺白芷陰性樣品；F.缺細辛陰性樣品圖1 混合對照品、供試品和陰性樣品的高效液相色譜圖

2.2.4 線性關系考察

取適量2.2.2項下混合對照品溶液，用甲醇分別稀釋成系列質量濃度的混合對照品溶液，阿魏酸分別為6.34，9.51，12.68，15.85，19.02，31.70 mg/L，升麻素苷分別為5.19，7.79，10.38，12.98，15.57，25.95 mg/L，歐前胡素分別為4.38，6.57，8.76，10.95，13.14，21.90 mg/L，細辛脂素分別為5.35，8.03，10.70,13.38，16.05，26.75 mg/L，在實驗所需的色譜條件下進樣測定，取對照品的峰面積(A) 為縱坐標，濃度(C) 為橫坐標，繪制標準曲線，線性關系考察結果見表1。

表1 4種成分的線性關系考察結果

2.2.5 精密度實驗

取同一供試品溶液10 μL，用上述2.2.3項下色譜條件，重復進樣6次，測峰面積，計算升麻素苷、阿魏酸、歐前胡素、細辛脂素峰面積的RSD分別為0.88%、0.95%、0.92%、0.67%。結果表明，該方法所用儀器精密度良好。

2.2.6 重復性實驗

采用2.2.1項下的方法制備供試品溶液6份，按照2.2.3項下的色譜條件進樣，計算升麻素苷、阿魏酸、歐前胡素、細辛脂素的RSD分別為1.07%、0.72%、1.56%、1.16%。結果表明，供試品溶液制備方法重復性良好。

2.2.7 穩定性實驗

取同一五行香草方供試品溶液，分別在室溫下存放0，2，4，8，12，24 h后，采用2.2.3項下色譜條件進樣，記錄峰面積。結果：升麻素苷、阿魏酸、歐前胡素、細辛脂素的RSD分別為0.59%、0.96%、1.13%、1.43%。結果表明，供試品溶液所含的4種成分在24 h內穩定。

2.2.8 加樣回收率實驗

取已知含量的五行香草軟膏樣品6份，分別加入混合對照品溶液1 mL，按照2.2.1項下方法制備供試品溶液，采用2.2.3.項下色譜條件進樣，記錄峰面積，按以下公式計算供試品溶液中各對照品的總量和對照品的加樣回收率。

供試品含量=測得量(μg)/進樣體積(μL)×溶液體積(50 mL)

加樣回收率=[測得對照品總量(μg)-樣品中對照品含量(μg)]/對照品加入量(μg)×100%

升麻素苷、阿魏酸、歐前胡素、細辛脂素的平均回收率分別為99.81%、99.53%、101.87%、97.35%,RSD分別為1.56%、2.86%、1.19%、2.23%。結果表明，該方法的回收率符合要求。

2.2.9 五行香草軟膏樣品的含量測定結果

按2.2.1項下的方法制備供試品溶液，按照2.2.3 色譜條件進樣，測定樣品中的歐前胡素、阿魏酸、升麻素苷、細辛脂素含量，結果見表2。

表2 五行香草軟膏樣品的含量測定結果μg·g-1

3 討 論

隨著中醫藥的發展，中藥制劑的劑型越來越多元化，院內制劑得到了空前發展。本研究考慮到五行香草軟膏的主治病癥為腳氣病，膿包、潰爛不可避免，而油脂性基質較油膩，疏水性大，不適于炎性滲出的創面。水溶性基質多由水溶性高分子物質組成，無刺激性[20-21]，結合釋藥速率、延展性、穩定性等多重因素，選擇了O/W型乳膏劑，不僅釋藥速率快，對破損皮膚的刺激性較小，安全性更高。

筆者通過查閱文獻[22-25]選取歐前胡素、阿魏酸、細辛脂素、升麻素苷作為五行香草軟膏的定量測定指標，考慮到指標多而采用梯度洗脫，在檢測波長287 nm、柱溫30 ℃的色譜條件下進行檢測以確保測定指標均能在對應譜圖中出峰。其中細辛脂素來源于細辛，阿魏酸來源于川芎、藁本，歐前胡素來源于白芷，升麻素苷來源于防風，4種成分無干擾即專屬性良好，且有良好的精密度和重現性，可用于五行香草軟膏的定量測定。本實驗含量測定穩定性好，數據可靠，為五行香草軟膏作為院內制劑的開發提供了理論支撐。