清熱除濕方對潰瘍性結腸炎小鼠的治療作用*

黨全偉，鐘 鑫，郭曉燕

(1.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000； 2.鄭州卷煙廠康復醫院，河南 鄭州 450004； 3.河南省中醫藥研究院，河南 鄭州450004)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性炎癥性疾病，在全球范圍內有較高的患病率[1]。UC的發病率和流行率在發展中地區(包括亞洲國家)正逐年增高[2]。UC的病情復雜，難以痊愈，常反復發作，致癌率高。UC的發病率具有年齡依賴性，年齡分布呈雙峰，第一個高峰在15～30歲之間，第二個高峰在50～70歲之間[3]。目前，UC的治療藥物局限于氨基水楊酸鹽制劑、柳氮磺吡啶、抗生素、類固醇和免疫抑制劑[4]，療效欠佳、副作用多，且有停藥后易復發、價格昂貴等缺點[5]。中醫藥治療UC有一定的優勢[6]。清熱除濕方由葛根、黃芩、川黃連、太子參、白扁豆、山藥、砂仁、廣木香、烏藥、山楂炭、車前子、甘草片、紅棗組成，臨床治療UC疾病取得了良好的療效[7]。王師英等[7]論述了清熱除濕方對潰瘍性結腸炎的治療作用，并推測涉及的機制可能是抗炎、抗免疫。本實驗以30 g/L硫酸葡聚糖鈉鹽(dextran sodium sulfate，DSS)制備小鼠UC模型，研究清熱除濕方對UC小鼠的治療，并探究其機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

50只SPF級雄性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物質量合格證號為110324201102552674，實驗動物生產許可證編號SCXK(京)2021-0006,飼養于河南省中醫藥研究院動物中心，實驗單位使用許可證號為SYXK(豫)2019-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

葛根、黃芩、川黃連、太子參、白扁豆、山藥、砂仁、廣木香、烏藥、山楂炭、車前子、甘草片、紅棗均購于河南省張仲景大藥房，經河南省中醫藥研究院中藥所劉長河副研究員鑒定為正品。美沙拉嗪緩釋顆粒，上海愛的發制藥有限公司產品，產品批號210901；DSS，美國MP Biomedicals 有限責任公司產品，批號160110；白細胞介素(interleukin，IL)-6(批號SEKM-0007)、IL-1β(批號SEKM-0002)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α(批號SEKM-0034)酶聯免疫試劑盒，北京索萊寶生物試劑有限公司提供；40 g/L 多聚甲醛組織固定液，武漢塞維爾生物科技有限公司產品，批號G1101；逆轉錄試劑盒，賽默飛世爾科技公司產品，批號00780630；熒光定量PCR試劑盒，白鯊公司產品，批號BL698A； PCR引物由金唯智生物技術有限公司合成。Synergy NEO全功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司產品；CKX53倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品； Leica ASP200S脫水機、EG1150H石蠟包埋機、RM2235病理切片機，均為德國徠卡儀器有限公司產品；Labcycler 96梯度PCR儀，德國圣歐公司產品；QuantStudio 5 PCR儀，賽默飛世爾科技公司產品。

1.3 藥物制備

處方組成：葛根15 g，黃芩12 g，川黃連6 g，太子參12 g，白扁豆30 g，山藥30 g，砂仁10 g，廣木香6 g，烏藥12 g，山楂炭15 g，車前子15 g，甘草片3 g，紅棗3枚為引。根據臨床用藥量，按照體表面積法計算小鼠給藥劑量，將質量分數4.0 g/mL生藥含量作為高劑量，2.0 g/mL作為低劑量，灌胃體積為10 μL/g，即給藥劑量依次40，20 g/kg。

1.4 動物分組，模型建立與給藥

將50只小鼠按體質量“Z”型分組，分為正常組、模型組、美沙拉嗪組、清熱除濕方低劑量組、清熱除濕方高劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組小鼠按照參考文獻[8]建立模型，自由飲用質量分數30 g/L DSS溶液共7 d；正常組自由飲用滅菌后的超純水。造模的同時灌胃給藥，美沙拉嗪組給予0.9 g/mL美沙拉嗪溶液，清熱除濕低劑量組、清熱除濕高劑量組依次給予質量分數為2.0 ，4.0 g/mL的清熱除濕方溶液，正常組和模型組給予蒸餾水，灌胃體積10 μL/g，1 d 1次，連續給藥7 d。第6天給藥后，晚20時小鼠禁食不禁水12 h。

1.5 檢測指標

1.5.1 標本的采集

末次給藥后1 h，用乙醚麻醉小鼠，眼球取血0.5～1 mL，滴入1.5 mL離心管中；以7 cm為離心半徑、3 000 r /min轉速離心15 min；吸取上清液，分裝于200 μL微量離心管中，放于-80 ℃儲存。采血后，頸椎脫臼處死小鼠，剪開腹部，摘取小鼠結腸組織；以生理鹽水沖洗結腸，進行結腸宏觀病理學觀察，然后剪成長度約1 cm的小結，放于40 g/L多聚甲醛固定液中固定，用于蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.5.2 疾病活動指數評分

每天稱量各組動物的體質量，觀察糞便性狀和出血情況，并記錄。取最后1天體質量、糞便性狀及血便數據，計算疾病活動指數(disease activity index，DAI)。DAI =(體質量減輕分數+大便性狀分數+血便分數)/3。評分標準[9]見表1。

表1 DAI評分標準

1.5.3 結腸黏膜損傷指數評分

分離結腸后，沿腸系膜縱軸剪開，用生理鹽水將糞便及食物殘渣洗凈，肉眼觀察結腸黏膜色澤、充血、水腫及糜爛、潰瘍面情況，評估結腸黏膜損傷指數，評分標準[10]見表2。

表2 結腸黏膜損傷指數評分標準

1.5.4 IL-1β、IL-6、TNF-α含量

采用酶聯免疫法檢測各組小鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，操作按試劑盒說明書進行。

1.5.5 結腸組織病理學形態

將固定好的結腸組織取出，制片，采用蘇木素-伊紅(HE)染色法，光學顯微鏡下觀察。

1.5.6 結腸組織中IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達

采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測。將結腸組織研碎，加入1 mL TRIzol裂解，分別提取各組總RNA。逆轉錄為cDNA，逆轉錄反應條件：42 ℃15 min，85 ℃5 min。以cDNA為模板擴增IL-1β、IL-6、TNF-α，以GAPDH為內參。引物序列見表3。聚合酶鏈反應擴增條件：95 ℃5 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，40個循環。測樣結束后，將所得數據通過2-△△Ct計算各個樣本與內參之間的相對定量值。本實驗內參基因為GAPDH，分別計算各個樣本的基因相對表達量。

表3 引物名稱及序列

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 各組小鼠DAI評分對比

與正常組對比，模型組DAI評分升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組對比，各給藥組DAI評分均降低，美沙拉嗪組和清熱除濕方高劑量組差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠DAI評分對比分，

2.2 各組小鼠結腸黏膜損傷指數評分對比

與正常組對比，模型組結腸黏膜損傷指數評分升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組對比，各給藥組的結腸黏膜損傷指數評分均降低，清熱除濕方高劑量和美沙拉嗪組差異有統計學意義(P<0.05)。與美沙拉嗪組對比，清熱除濕方低、高劑量組的評分均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組小鼠結腸黏膜損傷指數評分對比 分，

2.3 各組小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量對比

與正常組對比，模型組小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組對比，各給藥組的3個指標都有降低的趨勢，美沙拉嗪組和清熱除濕方高劑量組效果明顯。見表6。

表6 各組小鼠血清中炎癥IL-1β、IL-6、TNF-α含量對比

2.4 各種小鼠結腸組織病理學形態對比

正常組小鼠結腸結構完整，黏膜無明顯缺損，腺體排列整齊，未見炎性細胞浸潤。模型組小鼠隱窩喪失，炎性細胞浸潤和杯狀細胞耗竭。各給藥組結腸組織中的上述病理變化得到改善，其中清熱除濕方高劑量組和美沙拉嗪組改善效果明顯。見圖1。

A.正常組;B.模型組;C.美沙拉嗪組；D. 清熱除濕方低劑量組;E. 清熱除濕方高劑量組

2.5 各組小鼠結腸組織IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達對比

與正常組對比，模型組IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組對比，各給藥組的3個指標均降低，其中美沙拉嗪組、清熱除濕方高劑量組差異有統計學意義(P<0.05)。與美沙拉嗪組對比，清熱除濕低、高劑量組的IL-1β mRNA、TNF-α mRNA降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表7。

表7 各組小鼠結腸組織IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達對比

3 討 論

潰瘍性結腸炎的發病機制復雜，涉及環境因素、遺傳因素、腸道菌群因素等[11]。臨床表現包括腹痛、腹瀉、黏液膿血便和里急后重等,病程較長,易反復發作,甚至癌變,嚴重影響患者的生存質量[12]。病情嚴重時可導致腸穿孔、中毒性巨結腸等相關疾病，病情更為復雜，治療難度增加[13]。臨床上，UC尚無有效的根治方法，常規用于UC治療的藥物大多數會產生副作用，并且無論是潰瘍性結腸炎自身還是其治療藥物都會增加并發癥如結腸癌、皮膚癌[14]、骨骼疾病[15]、焦慮抑郁[16]等疾病的風險。因此，尋找新的安全高效的藥物是非常必要的。

中藥性質溫和、不良反應少，辨證論治注重整體觀，可達到標本兼治的目的[17]。近年來，中醫藥研究者已經證實，中藥在改善UC臨床總療效、證候療效、腸鏡和病理療效、緩解率、復發率等方面具有顯著療效[18]。UC的基本病機是邪滯腸道、濕熱壅盛、氣血凝滯，治療原則以清熱化濕為基礎[19]。曹飛燕等[20]基于文獻學方法研究了潰瘍性結腸炎的中醫證候要素分布規律及治法，得出排在前5位的治法是清熱化濕、溫腎健脾、疏肝健脾、活血化瘀、澀腸止瀉。清熱除濕方中，葛根為君藥，其味甘辛而性涼，入脾、胃、經，既能解表退熱，又能升發脾胃清陽之氣而治下利。黃連、黃芩味苦性寒，清熱燥濕，厚腸止利；太子參益氣健脾滲濕；白扁豆、山藥健脾益氣，兼止瀉。此三味藥為臣藥。砂仁、木香醒脾和胃，行氣化滯；烏藥味辛性溫，行氣止痛，溫腎散寒；山楂炭味酸甘，性微溫，入脾、胃、肝經，有消食健胃、活血化瘀、收斂止痢之功能；車前子味甘性寒，入腎、膀胱、肝、肺經，能利水通淋、滲濕止瀉。以上5味藥共為佐藥。甘草片、大棗健脾和中，調和諸藥，共為使藥。綜觀全方，清濕熱，補中氣，滲濕濁，行氣滯，使脾氣健運，濕邪得去，則諸癥自除。研究表明，抗炎癥反應是清熱除濕中藥治療UC的重要作用機制，可通過減少結腸黏膜組織中炎癥因子與浸潤的炎性細胞，進而減輕組織損傷[21-22]。DSS誘導的結腸炎小鼠常被用作實驗性UC模型，具有與人類UC相似的臨床和組織學特征，以質量分數為30 g/L的 DSS溶液喂養7 d建立的UC小鼠模型為最佳[23-24]。因此本實驗以此法造模。本研究顯示，當潰瘍性結腸炎發生時，小鼠的結腸黏膜損傷指數和DAI評分升高，結腸組織有明顯潰瘍、大片黏膜脫落、腺體結構破壞、大量炎性細胞浸潤等現象。給予藥物治療后，各給藥組小鼠結腸黏膜損傷指數和DAI評分降低，結腸組織充血程度、腺體破壞程度、炎癥細胞浸潤程度均較模型組有所減輕。炎癥因子的過度產生在UC的發生、發展中起了重要作用。為了進一步探究藥物對各組小鼠的影響，本實驗檢測各組小鼠體內促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β的含量，結果顯示：模型組小鼠促炎因子高表達，與正常組對比明顯升高；進行藥物干預后，各給藥組的3個指標有降低的趨勢。

綜上所述，清熱除濕方能夠抵抗30 g/L 誘導的UC疾病從而保護結腸損傷，其可能是通過降低組織中炎癥細胞浸潤和炎癥因子的含量，從而降低了結腸黏膜炎癥的發生率及嚴重程度。