黃芪湯對肝硬化門靜脈高壓癥大鼠門靜脈壓力的影響及作用機制研究

王浩藝，黃廣建，劉從進，陳高峰，陳天陽，成揚，3

1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝病研究所，上海 201203；2.復旦大學附屬華山醫(yī)院，上海 200040；3.上海中醫(yī)藥大學肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海 201203

肝硬化門靜脈高壓癥（cirrhotic portal hypertension，CPH）是指在肝硬化基礎(chǔ)上，門靜脈系統(tǒng)血流受阻或血流量增加，導致門靜脈及其屬支壓力升高，并由此引起的一系列臨床綜合征，其中上消化道出血是CPH最主要的并發(fā)癥。目前西藥治療存在諸多禁忌癥及耐藥性等問題，外科治療也存在風險，無法解決引起CPH的根本原因——肝纖維化，相反可能因肝臟血流量減少不利于肝損傷的修復。相關(guān)Meta分析顯示，中醫(yī)藥在治療肝硬化患者門靜脈高壓癥、改善血流動力學方面優(yōu)于普萘洛爾，針對CPH當前治療存在的困境，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥寶庫中挖掘防治措施十分必要。

基于肝硬化“虛損生積”理論，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪湯可有效改善乙肝后肝硬化患者肝功能，減少門靜脈內(nèi)徑，改善食管胃底靜脈曲張程度，減小血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）含量。但其具體作用機制尚未明確。為此，本研究采用膽管結(jié)扎術(shù)制備CPH大鼠模型，基于VEGF及其下游信號通路觀察黃芪湯對模型大鼠門靜脈壓力的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量（180±10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCX（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心清潔級動物房，溫度（20±2）℃、相對濕度50%～60%環(huán)境，12 h光照周期，自由進食飲水。適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學倫理委員會批準（PZSHUTCM2019041835）。

1.2 藥物及制備

黃芪湯（炙黃芪30 g，炙甘草5 g）顆粒，江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司提供（批號1212353），1.2 g黃芪湯顆粒相當于黃芪原藥材6 g、炙甘草原藥材1 g。實驗時用蒸餾水配制成濃度為35、70、140 mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

大鼠VEGF ELISA檢測試劑盒，上海晶抗生物公司，貨號JLC2293；DAB顯色試劑盒，南京建成生物工程研究所，貨號W026-1-2；血管性血友病因子（vWF）抗體、CD31 抗體、VEGF 抗體，美國Proteintech 公司，貨號分別為27186-1-AP、66065-2-Ig、66828-1-Ig；GAPDH 抗體、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抗體、p-PI3K抗體、蛋白激酶B（Akt）抗體、p-Akt抗體、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體，美國Cell Signaling Technology公司，貨號分別為5174、4249、4228、4685、4060、32027。Power Lab生理數(shù)據(jù)處理和分析系統(tǒng)，澳大利亞ADI公司；SCN400型數(shù)字化病理切片掃描儀，德國Leica公司；Excelsior ES全自動組織脫水機，美國Thermo Fisher Scientific 公司；HD-330型烤片機，天津市惠達實驗儀器有限公司；DENLEY DRAGON Wellscan MK3酶標儀，美國Thermo公司；Wellwash 4 MK2洗板機，美國Thermo公司；Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)，美國Li-Cor公司。

2 實驗方法

2.1 造模

將50只大鼠隨機分為假手術(shù)組（10只）和造模組（40只）。參考文獻[8]采用膽管結(jié)扎術(shù)制備CPH大鼠模型：稱量大鼠體質(zhì)量，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（2 mL/kg），仰臥位固定于實驗臺，皮膚消毒，于劍突下沿腹正中行一約3 cm切口，暴露肝臟，分離膽總管，手術(shù)縫線雙重結(jié)扎后離斷，連續(xù)縫合肌層關(guān)腹。假手術(shù)組開腹后僅牽引膽總管但不做離斷結(jié)扎。

2.2 分組及給藥

大鼠行結(jié)扎術(shù)后禁食12 h，禁水4 h。1周后將造模大鼠隨機分為模型組和黃芪湯低、中、高劑量組，黃芪湯低、中、高劑量組分別予黃芪湯0.35、0.70、1.40 g/kg灌胃（相當于60 kg成人臨床用量的3.5、7、14倍），灌胃體積1 mL/100 g，假手術(shù)組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，每周灌胃6 d，連續(xù)4周。

2.3 門靜脈壓力測定

給藥結(jié)束后，3%戊巴比妥鈉腹腔注射（2 mL/kg）麻醉大鼠，將大鼠固定于37 ℃保溫玻璃板上，沿腹壁正中剪一2 cm切口，打開腹腔，暴露門靜脈主干，分離腸系膜上靜脈，將遠離門靜脈的一端結(jié)扎后剪一“V”形切口，插入PE-10管至門靜脈，接通壓力換能器，檢測門靜脈壓力。

2.4 取材

門靜脈壓力測定完畢后，下腔靜脈取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，分離血清，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。摘取肝臟，切取肝右葉同一位置組織（約1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm），置于10%福爾馬林溶液中固定，用于組織病理學檢測。稱取100 mg 肝組織，置于-80 ℃保存，用于Western blot檢測。

2.5 ELISA檢測

采用ELISA檢測血清VEGF含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

2.6 天狼猩紅染色

大鼠肝組織經(jīng)10%福爾馬林溶液固定后，經(jīng)組織脫水機脫水，石蠟包埋，切片（厚約5 μm），天狼猩紅染色觀察肝組織纖維化程度，以數(shù)字化病理切片掃描儀進行掃描分析，采用Image Scope軟件計算膠原染色面積。

2.7 免疫組化染色

石蠟切片65 ℃烤片60 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；置于枸櫞酸緩沖液中，微波爐100 ℃、8 min，60 ℃、25 min進行抗原修復，自然冷卻至室溫，PBS洗3次，3%HO滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加vWF一抗（1∶200）、CD31一抗（1∶600），4 ℃孵育過夜；次日37 ℃水浴箱復溫45 min，滴加相應二抗（1∶10 000），37 ℃孵育20 min；DAB避光顯色3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，光學顯微鏡下觀察，以黃色或棕黃色顆粒為陽性表達，采用Image J軟件計算陽性表達的平均光密度。

2.8 Western blot檢測

取100 mg肝組織加入1 mL裂解液，高速分散機進行勻漿，冰上靜置30 min，4 ℃、12 000×離心15 min，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，吸取30 μg蛋白置于10%SDS聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離后，半干法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，Odyssey緩沖液封閉1 h，加入VEGF一抗（1∶1 000）、p-PI3K一抗（1∶1 000）、PI3K 一抗（1∶1 000）、p-Akt一抗（1∶2 000）、Akt一抗（1∶1 000）、eNOS一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入相應二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)掃描并分析，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 黃芪湯對模型大鼠門靜脈壓力的影響

實驗期間，模型組大鼠死亡2只、黃芪湯低劑量組死亡1只，其余各組大鼠無死亡。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠門靜脈壓力顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，黃芪湯中、高劑量組大鼠門靜脈壓力顯著降低（＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠門靜脈壓力比較（，mm Hg）

4.2 黃芪湯對模型大鼠血清血管內(nèi)皮生長因子含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清VEGF含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）；與模型組比較，黃芪湯各劑量組大鼠血清VEGF含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），以黃芪湯高劑量組下降最顯著（＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清VEGF含量比較（，pg/mL）

4.3 黃芪湯對模型大鼠肝組織病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠肝組織僅匯管區(qū)和中央靜脈周圍有極少量陽性染色；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織膠原染色面積顯著增加（＜0.01），以匯管區(qū)為中心向肝實質(zhì)放射狀延伸，有假小葉形成；與模型組比較，黃芪湯各劑量組大鼠肝組織膠原染色面積顯著減少（＜0.05），纖維間隔變窄變細，以黃芪湯高劑量組效果最為明顯（＜0.05）。見表3、圖1。

圖1 各組大鼠肝組織形態(tài)（天狼猩紅染色，×100）

表3 各組大鼠肝組織膠原染色面積比較（，%）

4.4 黃芪湯對模型大鼠肝組織血管性血友病因子、CD31表達的影響

vWF和CD31是肝硬化肝竇毛細血管化的重要分子指標。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織vWF、CD31表達顯著升高（＜0.05），主要表達在增生膽管周圍，小葉中央靜脈周圍、匯管區(qū)；與模型組比較，黃芪湯各劑量組大鼠肝組織vWF、CD31陽性表達顯著降低（＜0.05），其中以黃芪湯高劑量組效果最明顯（＜0.05）。見圖2、圖3、表4。

表4 各組大鼠肝組織vWF、CD31陽性表達比較（）

圖2 各組大鼠肝組織vWF陽性表達（免疫組化染色，×100）

圖3 各組大鼠肝組織CD31陽性表達（免疫組化染色，×100）

4.5 黃芪湯對模型大鼠肝組織VEGF/PI3K/Akt/eNOS信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織VEGF、eNOS蛋白表達顯著升高，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，黃芪湯各劑量組大鼠肝組織VEGF、eNOS蛋白表達顯著降低，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值顯著降低，且黃芪湯高劑量組效果最明顯（＜0.05）。見圖4、表5。

圖4 各組大鼠肝組織VEGF、PI3K、Akt、eNOS蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠肝組織VEGF、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、eNOS蛋白表達比較（）

5 討論

結(jié)合癥狀體征，CPH可屬中醫(yī)學“積病”“臌脹”等范疇，張景岳強調(diào)“虛弱失調(diào)之人，多有積病”（《景岳全書·積聚》），李中梓指出“積之成者，正氣之不足也，而后邪氣居之”（《醫(yī)宗必讀》）。黃元御認為，臌脹之根源在于“中氣敗壞，水不化氣而泛濫于上”。黃芪湯出自北宋《太平惠民和劑局方》，為黃芪與甘草6∶1相須配伍，擅補諸虛不足?；诖?，本研究探索益氣補虛的黃芪湯對膽管結(jié)扎致CPH大鼠門靜脈壓力的影響及其作用機制。

在肝硬化尤其CPH患者中，血清VEGF水平明顯高于正常人，且與肝功能不全嚴重程度呈正相關(guān)，因此下調(diào)血清VEGF水平對降低CPH患者門靜脈壓力有重要意義。本實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠門靜脈壓力顯著升高，血清VEGF水平顯著升高，經(jīng)黃芪湯干預后，大鼠門靜脈壓力、血清VEGF水平顯著降低，且以黃芪湯高劑量組更明顯。天狼猩紅染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織膠原沉積明顯，假小葉大量形成，黃芪湯干預后，大鼠肝組織膠原沉積明顯減少，其中黃芪湯高劑量組效果最為明顯，提示黃芪湯能改善大鼠肝纖維化程度，降低門靜脈壓力，與降低血清VEGF水平密切相關(guān)。

肝竇毛細血管化是肝竇內(nèi)皮細胞血管重構(gòu)的一種表現(xiàn)，與門靜脈高壓的形成密切相關(guān)。VEGF是肝竇內(nèi)皮細胞表型調(diào)節(jié)器，參與肝竇毛細血管化過程。在肝纖維化及門靜脈高壓的形成過程中，常伴有血管過度增生和VEGF水平升高，導致門靜脈系統(tǒng)血流量增加，加速門體側(cè)支循環(huán)形成，惡化高動力循環(huán)狀態(tài)，最終使肝纖維化、門靜脈高壓與血管重構(gòu)、過度增生之間呈現(xiàn)惡性循環(huán)。vWF和CD31是反映肝竇毛細血管化、肝竇內(nèi)皮細胞表型變化的重要指標。本實驗免疫組化結(jié)果顯示，與模型組比較，黃芪湯各劑量組大鼠肝組織vWF和CD31表達明顯降低，結(jié)合黃芪湯對門靜脈壓力的影響及肝竇毛細血管化與門靜脈高壓的相關(guān)性，說明黃芪湯降低門靜脈壓力與改善肝竇內(nèi)皮細胞毛細血管化密切相關(guān)。

VEGF作為目前發(fā)現(xiàn)的特異性高、作用強的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，能促使血管內(nèi)皮細胞增殖遷移，增強血管通透性，從而促進血管重構(gòu)與新生。VEGF介導的PI3K/Akt/eNOS信號傳導通路在CPH發(fā)生發(fā)展中占重要地位。eNOS是調(diào)控內(nèi)源性一氧化氮產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，VEGF能上調(diào)血管內(nèi)皮細胞鈣離子濃度，促進eNOS表達，介導一氧化氮生成，促進血管增生。Western blot 結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織VEGF、eNOS蛋白表達及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值明顯升高，黃芪湯各劑量組大鼠肝組織VEGF、eNOS蛋白表達及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值明顯降低，表明黃芪湯的作用與調(diào)控VEGF/PI3K/Akt/eNOS信號通路密切相關(guān)。

綜上所述，黃芪湯可抑制VEGF/PI3K/Akt/eNOS信號通路相關(guān)蛋白表達，降低血清VEGF含量，抑制肝竇毛細血管化，進而發(fā)揮抗肝纖維化、肝硬化，降低門靜脈高壓的作用。