姚雪含，劉喜平，朱中博

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

人體胃腸道通過多個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的作用形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，其中，穩(wěn)定的腸道菌群及結(jié)腸黏膜對(duì)維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要作用。一旦菌群受到破壞，有害菌過度增殖，進(jìn)而影響結(jié)腸黏膜的保護(hù)作用，可引發(fā)功能性胃腸疾病或炎癥性相關(guān)疾病。因此，平衡腸道菌群及預(yù)防結(jié)腸黏膜損傷，對(duì)構(gòu)建幼兒菌群平衡及防治腸上皮屏障損傷相關(guān)胃腸道疾病具有重要意義。

艾灸是一種中醫(yī)傳統(tǒng)外治法，具有溫經(jīng)散寒、扶正祛邪、平衡陰陽作用。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，艾灸可發(fā)揮溫?zé)嶙饔茫瑫r(shí)，艾煙及艾灰對(duì)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)、治療作用。通過刺激特定穴位，艾灸可發(fā)揮特定的靶向作用，還能通過下調(diào)促炎因子表達(dá)，對(duì)結(jié)腸黏膜起到抗炎修復(fù)作用。臨床研究表明，艾灸能調(diào)節(jié)患者腸道菌群結(jié)構(gòu)，修復(fù)損傷的腸道屏障。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，艾灸預(yù)處理“天樞”對(duì)大鼠腸黏膜屏障具有保護(hù)作用。關(guān)元溫腎以補(bǔ)虛、健脾而化濕，總領(lǐng)溫陽化濕之意，標(biāo)本兼治；神闕為周身神氣通行之門戶，具有振奮周身陽氣、助陽化濕作用，同時(shí)促進(jìn)經(jīng)氣運(yùn)行，通利氣機(jī)；中脘為脾胃氣機(jī)升降之樞紐，可健運(yùn)脾胃，使水谷運(yùn)化有權(quán)，水津分布有法，從根源上杜絕水濕蓄積；天樞為機(jī)體升清降濁之樞紐，可助大腸泌別清濁、淡滲利濕，使水濕之邪有路可出，同時(shí)天樞為陽明經(jīng)之募穴，陽明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，可行氣活血、健脾利濕。四穴共用，可益火生氣、化濕和中，使氣機(jī)流轉(zhuǎn)順達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察艾灸“神闕”“中脘”“關(guān)元”“天樞”對(duì)菌群失調(diào)幼鼠結(jié)腸黏膜屏障的影響，從腸道菌群角度探討艾灸保護(hù)結(jié)腸黏膜的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

3～4 周齡 SPF 級(jí)雄性 Balb/c 幼鼠 50 只，體質(zhì)量10～15 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度45%～60%。本研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020-264）。

1.2 試劑

細(xì)艾條（直徑7 mm，時(shí)時(shí)康艾灸堂），甲硝唑、硫酸新霉素、可溶性兩性霉素B、脂多糖（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為827L021、702I0512、511B059、408Z033），鹽酸萬古霉素（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)H13M11Y113102），氨芐西林膠囊（珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司中山分公司，批號(hào)96003103），雙歧桿菌四聯(lián)活菌片（杭州遠(yuǎn)大生物制藥有限公司，批號(hào)202005244），多聚甲醛溶液、PBS、中性樹膠、伊紅、蘇木素（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為 20191202、20200709、G8590、G1100、G1080），Occludin 抗體、ZO-1 抗體（英國 Abcam 公司，貨號(hào)分別為ab216327、ab96587）。

1.3 儀器

PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號(hào)T100），臺(tái)式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（余姚市星辰儀表廠，型號(hào)101-00），切片機(jī)（德國LEICA，型號(hào)2016），水浴鍋（江蘇榮華公司，型號(hào)SHA-C），顯微鏡（日本OLYMPUS，型號(hào)IX51），轉(zhuǎn)膜儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號(hào)JY-ZY5），電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號(hào)JY-SCZ2＋），高速冷凍離心機(jī)（美國BECKMAN，型號(hào)Microfuge 22R），超低溫冰箱（中科美菱低溫科技公司，型號(hào)DW-HL528），搖床（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，型號(hào)TS-92），酶標(biāo)儀（美國Thermo公司，型號(hào)Multiskan MK3），數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號(hào)ChemiDoc MP），恒溫水浴鍋（常州市江南儀器廠，型號(hào)HH-1）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液配制

參考文獻(xiàn)[8]方法，將氨芐西林、鹽酸萬古霉素、甲硝唑、硫酸新霉素、兩性霉素B用生理鹽水溶解，得到濃度分別為10、5、10、10、0.1 mg/mL的混合抗生素溶液。雙歧桿菌四聯(lián)活菌片用生理鹽水溶解，配制成濃度為68 mg/mL。

2.2 分組、造模及干預(yù)

50只幼鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取10只作為空白組，其余幼鼠每12 h予混合抗生素溶液灌胃（氨芐西林100 mg/kg、鹽酸萬古霉素50 mg/kg、甲硝唑100 mg/kg、硫酸新霉素100 mg/kg、兩性霉素B 1 mg/kg）復(fù)制抗生素暴露模型，灌胃體積10 mL/kg，連續(xù)灌胃14 d后，將幼鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、陽性藥組、艾灸組和聯(lián)合組，每組10只。艾灸組固定于鼠板，將艾條固定在艾灸架上，垂直“神闕”“中脘”“關(guān)元”“天樞”上方點(diǎn)燃施灸，每穴4壯，15 min/次，施灸過程中使用表面測(cè)溫儀測(cè)定體表溫度，適時(shí)去除艾灰，調(diào)整施灸高度，確保體表溫度在40 ℃左右；陽性藥組予雙歧桿菌四聯(lián)活菌片溶液0.68 g/kg灌胃，灌胃體積10 mL/kg，同時(shí)固定相同時(shí)間；聯(lián)合組艾灸同時(shí)予0.68 g/kg雙歧桿菌四聯(lián)活菌片溶液灌胃。1次/d，連續(xù)14 d。空白組只固定不干預(yù)，模型組予等量生理鹽水灌胃，同時(shí)固定相同時(shí)間。

2.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性檢測(cè)

末次干預(yù)12 h后收集幼鼠糞便（約200 mg），放于1.5 mL EP管中，置于-80 ℃冰箱保存，用于測(cè)序分析。采用Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)，提取全基因組DNA，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域，使用帶Barcode的特異引物和高效高保真酶進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用TruSeqDNA PCR-Free Sample Preparation Kit進(jìn)行文庫構(gòu)建，經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。利用Uparse 算法（http://www.drive5.com/uparse/）對(duì)所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，篩選出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列，作物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1），并根據(jù)OTU分類對(duì)腸道菌群的α、β多樣性及物種差異進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)由蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司提供技術(shù)支持。

2.4 結(jié)腸組織病理形態(tài)觀察

收集糞便6 h后，各組幼鼠均按10 mg/kg腹腔注射脂多糖（3 mg/mL）誘導(dǎo)腸道炎性反應(yīng)。12 h后脫頸處死幼鼠，收集結(jié)腸組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（厚度5 μm），二甲苯脫蠟5 min×2次，蘇木素染色3 min，水洗1 min，伊紅染色2 min，水洗30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化。

2.5 結(jié)腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)檢測(cè)

切取近端結(jié)腸組織約200 mg，剪碎后加入1 mL裂解液，冰上研磨30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度；加入5×loading buffer，水浴加熱變性后，每孔15 μL上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；滴加Occludin、ZO-1一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5次，每次6 min；滴加二抗（1∶4 000），室溫孵育90 min，TBST洗膜5次，每次6 min；TBS浸泡2 min，ECL發(fā)光液顯影，數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)成像，采用Image J 8.0軟件測(cè)量條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 艾灸對(duì)模型幼鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

4.1.1 物種分布情況

在門分類水平上，空白組幼鼠腸道擬桿菌門與厚壁菌門豐度之和超過總微生物群落的90%；變形菌門豐度較低，為4%；疣菌門豐度不足1%。模型組幼鼠腸道微生物群落豐度發(fā)生變化，與空白組比較，模型組幼鼠腸道擬桿菌門、厚壁菌門豐度顯著減少（＜0.01），變形菌門豐度顯著增加（＜0.01），疣菌門差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與模型組比較，陽性藥組、艾灸組和聯(lián)合組幼鼠腸道擬桿菌門豐度顯著增加（＜0.01），變形菌門豐度顯著減少（＜0.01），艾灸組幼鼠腸道厚壁菌門、疣菌門豐度顯著增加（＜0.01），陽性藥組及聯(lián)合組腸道厚壁菌門、疣菌門豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見表1、圖1。

表1 各組幼鼠腸道菌群門水平豐度比較（，%）

圖1 門分類水平下各組幼鼠腸道菌群相對(duì)豐度比較

4.1.2 α多樣性分析

α多樣性可以反映樣品內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性，常用物種累積箱形圖和一系列分析指數(shù)表示。各組幼鼠的物種累積箱形圖顯示，物種數(shù)量隨著樣本量的增加趨于平緩，表明本實(shí)驗(yàn)樣本量充足，足夠反映樣品的菌群數(shù)量。見圖2。

圖2 各組幼鼠腸道菌群物種累積箱形圖

物種多樣性指數(shù)包括Shannon、 Simpson，Shannon越高、Simpson越低，表示菌群多樣性越高，物種分布越均勻。物種豐富度指數(shù)包括Chao1、ACE，Chao1、ACE越高，表示物種豐富度越高。與空白組比較，模型組幼鼠腸道菌群Shannon、Chao1、ACE均顯著降低（＜0.01），Simpson顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、艾灸組和聯(lián)合組幼鼠腸道菌群Shannon 顯著升高（＜0.01），Simpson 顯著降低（＜0.01），陽性藥組幼鼠腸道菌群Chao1、ACE均顯著降低（＜0.05）。見表2。

表2 各組幼鼠腸道菌群α多樣性比較（）

4.1.3 β多樣性分析

β多樣性分析是對(duì)不同樣品的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行分析，其中主坐標(biāo)分析（PCoA）是通過一系列特征值和特征向量排序，從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結(jié)構(gòu)。PCoA結(jié)果顯示，各組幼鼠腸道菌群密度不同、區(qū)域分散，模型組與空白組距離較遠(yuǎn)，3個(gè)干預(yù)組距離更接近空白組。方差分析＞1、＜0.05，提示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 各組幼鼠腸道菌群PCoA

4.2 艾灸對(duì)模型幼鼠結(jié)腸黏膜病理形態(tài)的影響

空白組幼鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰，腺體完整，上皮細(xì)胞排列整齊。與空白組比較，模型組幼鼠結(jié)腸黏膜損傷嚴(yán)重，腺體消失，基層可見大量堆積的炎性細(xì)胞；與模型組比較，各干預(yù)組幼鼠結(jié)腸黏膜損傷減輕，腺體變長，可見少量炎性細(xì)胞浸潤；與艾灸組、陽性藥組比較，聯(lián)合組幼鼠結(jié)腸黏膜損傷較輕，炎性細(xì)胞浸潤較少。見圖4。

圖4 各組幼鼠結(jié)腸黏膜形態(tài)（HE染色，×200）

4.3 艾灸對(duì)模型幼鼠結(jié)腸組織Occludin、ZO-1 蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組幼鼠結(jié)腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、艾灸組和聯(lián)合組結(jié)腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05，＜0.01）；與艾灸組及陽性藥組比較，聯(lián)合組幼鼠結(jié)腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）。見圖5。

圖5 各組幼鼠結(jié)腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)比較（，每組3只）

5 討論

近年來，抗生素普遍用于嬰幼兒的臨床治療，但抗生素尤其廣譜抗生素會(huì)損害腸道菌群結(jié)構(gòu)及完整性，引起腸道菌群失調(diào)，導(dǎo)致腸內(nèi)病原菌大量釋放，損傷腸內(nèi)壁，引起炎癥，破壞結(jié)腸黏膜屏障，影響菌群定植并加重菌群紊亂。已有文獻(xiàn)報(bào)道，艾灸能調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，抑制炎癥因子釋放，上調(diào)Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)。為深入探討艾灸對(duì)抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)幼鼠結(jié)腸黏膜屏障的調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)開展了相關(guān)研究。

正常腸道微生物群主要由厚壁菌門和擬桿菌門組成，屬優(yōu)勢(shì)菌門，對(duì)維持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。變形桿菌是變形菌門的代表菌，是腸道的低豐度共生菌，屬條件致病菌。疣菌門在腸道中豐度不高，只包含Akkermansia muciniphila（AKK菌）1個(gè)成員，其與宿主代謝和免疫治療的全身效應(yīng)具有很強(qiáng)相關(guān)性，能誘導(dǎo)小鼠免疫球蛋白G1抗體和抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)黏膜愈合，屬于功能性益生菌。腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析表明，空白組幼鼠腸道優(yōu)勢(shì)菌群為擬桿菌門和厚壁菌門，變形菌門、疣菌門豐度較低，與文獻(xiàn)[15]一致。模型組幼鼠腸道變形菌門豐度增加，擬桿菌門和厚壁菌門豐度減少，疣菌門豐度無明顯變化。經(jīng)不同方法干預(yù)后，變形菌門豐度均顯著減少，擬桿菌門和厚壁菌門豐度增加，雖然與空白組有一定差異，但菌群結(jié)構(gòu)趨于正常。在腸道菌群α多樣性方面，模型組幼鼠腸道Chao1、ACE、Shannon降低，Simpson升高，說明腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，腸道菌群平衡被打破。陽性藥組、艾灸組和聯(lián)合組幼鼠腸道Shannon升高、Simpson降低，提示腸道菌群多樣性升高，平衡逐漸恢復(fù)。

脂多糖是先天免疫系統(tǒng)有效的激動(dòng)劑，能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的促炎反應(yīng)，刺激宿主細(xì)胞分泌促炎因子。經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)后，模型組幼鼠結(jié)腸黏膜損傷程度較嚴(yán)重，說明菌群紊亂影響結(jié)腸黏膜完整性，使其抵御炎性損傷的能力下降；與模型組比較，各干預(yù)組幼鼠結(jié)腸黏膜損傷有不同程度減輕，提示相對(duì)穩(wěn)定的腸道菌群能在一定程度上抵御炎性損傷，保護(hù)結(jié)腸黏膜。與艾灸組、陽性藥組比較，聯(lián)合組幼鼠結(jié)腸黏膜損傷最輕，結(jié)構(gòu)較為完整，無明顯炎性細(xì)胞浸潤，提示艾灸與陽性藥聯(lián)合使用能發(fā)揮協(xié)同保護(hù)作用。研究表明，艾灸可增加潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜緊密連接蛋白Occludin和ZO-1 表達(dá)，恢復(fù)結(jié)腸黏膜屏障功能，保護(hù)腸黏膜。另有報(bào)道，菌群豐度增加亦能提高相關(guān)蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中模型組幼鼠結(jié)腸組織Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)降低，不同方法干預(yù)后，Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)均升高，提示其保護(hù)結(jié)腸黏膜的機(jī)制與緊密連接蛋白具有相關(guān)性。

綜上所述，艾灸“神闕”“中脘”“關(guān)元”“天樞”對(duì)抗生素誘導(dǎo)的菌群失調(diào)幼鼠結(jié)腸黏膜屏障有良好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增加腸道菌群多樣性、恢復(fù)紊亂的腸道菌群水平及保護(hù)結(jié)腸黏膜屏障有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)可為臨床預(yù)防幼兒菌群紊亂及腸道炎癥疾病提供思路，為臨床合理應(yīng)用抗生素及防治結(jié)腸黏膜屏障損傷相關(guān)胃腸道疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。