經典名方銀翹散薄層鑒別標準提升研究

張會敏，宋健，徐林，董學，鐘方曉*

(1.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014；2.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)操作簡便、成本低、時間短、設備簡單，是中藥單味藥及復方制劑質量控制的主要方法[1-4]，是中藥質量標準的重要組成部分。目前，已上市中成藥品種約有6萬個批準文號，9 000多個質量標準。2020版《中國藥典》中銀翹散由金銀花、連翹、桔梗、薄荷、竹葉、荊芥穗、淡豆豉、牛蒡子、蘆根、生甘草10味中藥組成，其薄層鑒別項下僅對金銀花和連翹進行鑒別[5]，且連翹鑒別樣品制備需要通過大孔吸附樹脂柱，方法較繁瑣。研究人員對銀翹散袋泡茶[6]、銀翹口服液[7]及其他劑型[8]進行了薄層色譜鑒別，共同存在的問題是對每一種藥材進行鑒別時都需要單獨建立一種供試品制備方法，每展開一塊薄層板都需要不同的展開條件，耗時較長，有的操作較繁瑣，且多采用價格昂貴的單一對照品進行鑒別。

系列薄層色譜法，也有學者稱之為系統薄層色譜法或“整體鑒別”，是一種適用于分離、鑒別中藥復方復雜體系中單味藥的薄層色譜法[9-10]。首先，對同一份中藥復方制劑，采用不同極性試劑(從小到大)進行系統提取/萃取處理，得到不同極性部位的樣品供試品溶液，同法制備各單味藥的陰性供試品溶液，甲醇提取制備各對照藥材溶液；然后以對照藥材或對照品為對照，根據供試品極性大小、分離度，考察一系列展開劑，確定適合每種單味藥分離、鑒別的供試品溶液及展開劑；最后，每一塊展開的薄層板分別按照可見光—紫外—噴顯色劑—紫外—加熱—可見光—紫外的順序進行一系列觀察，確定適合鑒別每種單味藥的顯色方法；最終建立適合中藥復方中每一種單味藥的薄層色譜鑒別方法。近十年來，在利用不同極性溶媒分步提取制成幾種供試品溶液鑒別不同單味藥、同一種供試品溶液或同一種展開條件同時鑒別多個處方藥味、系列薄層色譜法鑒別單味藥方面已有不少探索[5,11-15]，但是多集中于單味藥或者小復方中幾味藥的鑒別，且未見采用系列薄層色譜法對銀翹散及其成方制劑中10味藥進行系統研究的報道。

本文利用系列薄層色譜法分別對銀翹散的10種單味藥進行鑒別探索，建立只制備一次供試品樣品，盡量使用對照藥材即可鑒別出銀翹散中的多種單味藥材的方法，為進一步完善提升《中國藥典》中銀翹散的質量標準提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

SB-5200DTS超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；BP211D型電子天平(德國Sartorius公司)；ZF-6型三用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；精宏DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；貝爾德939薄層制版器(重慶市南岸貝爾德儀器技術廠)；HH-4數顯恒溫水浴鍋(金壇市晶玻實驗儀器廠)；薄層層析硅膠G(青島海洋化工有限公司)；GF254薄層板20 cm×10 cm(煙臺市化學工業研究所)；羧甲基纖維素鈉300～8 000 mPa·s(國藥集團化學試劑有限公司)；甲醇、石油醚、乙酸丁酯、乙醇、氨水、甲苯、甲酸等均為分析純。

1.2 樣品及對照藥材

自制10批次銀翹散(S1～S10)；金銀花對照藥材(121060-201608)、連翹對照藥材(120908-201216)、薄荷對照藥材(120916-201812)、甘草對照藥材(120904-201620)、淡豆豉對照藥材(121594-201804)、荊芥穗對照藥材(121424-201505)、牛蒡子對照藥材(120903-201811)均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法及結果

2.1 供試品溶液制備

(1)步驟1

稱取銀翹散10.0 g，加甲醇30 mL超聲30 min，放置室溫，濾過，濾液加水10 mL，用石油醚(30～60 ℃)20 mL、乙酸乙酯5 mL混合溶劑萃取兩次，萃取后的水液備步驟2用，合并有機溶液層；減壓回收有機溶劑，殘渣加甲醇溶解，定容至1 mL，作為供試品溶液(A)(用于鑒別連翹和薄荷)。

(2)步驟2

(3)步驟3

步驟2中下層溶液1與下層溶液2合并，蒸干，用甲醇溶解定容至1 mL，作為供試品溶液(C)(用于鑒定金銀花)。

2.2 陰性對照溶液的制備

按銀翹散處方組成，分別稱取缺金銀花、連翹、薄荷、牛蒡子、淡豆豉、荊芥穗、甘草的陰性樣品，按照2.1項下銀翹散供試品溶液制備方法制備各陰性對照溶液。

2.3 對照藥材溶液的制備

取金銀花、薄荷各0.50 g，連翹、牛蒡子、甘草、淡豆豉、荊芥穗對照藥材各1.00 g，分別加甲醇2.0、2.0、1.5、1.5、1.5、1.5、2.0 mL浸泡過夜，分取上清液作為各對照藥材溶液。

2.4 薄層色譜鑒別

2.4.1 金銀花的鑒別

注：1—金銀花陰性溶液；2—金銀花對照藥材；3～12—供試品溶液C。圖1 金銀花TLC鑒別Fig.1 Identification of Lonicerae Japonicae Flos using TLC

2.4.2 連翹的鑒別

注：1～5、8～12—供試品溶液A；6—連翹陰性溶液；7—連翹對照藥材。圖2 連翹TLC鑒別(可見光)Fig.2 Identification of Forsythiae Fructus using TLC (visible light)

2.4.3 薄荷的鑒別

注：1—薄荷陰性溶液；2—薄荷對照藥材；3～12—供試品溶液A。圖3 薄荷TLC鑒別(365 nm紫外光)Fig.3Identification of Menthae Haplocalycis herba using TLC (365 nm ultraviolet light)

2.4.4 牛蒡子、甘草共同鑒別

注：1～5、10～14—供試品溶液B；6—牛蒡子對照藥材;7—牛蒡子陰性溶液;8—甘草陰性溶液;9—甘草對照藥材。圖4 甘草TLC鑒別Fig.4 Identification of Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma using TLC

注：1～5、10～14—供試品溶液B；6—牛蒡子對照藥材；7—牛蒡子陰性溶液；8—甘草陰性溶液；9—甘草對照藥材。圖5 牛蒡子TLC鑒別(可見光)Fig.5 Identification of Arctii Fructus using TLC (visible light)

2.4.5 淡豆豉、荊芥穗共同鑒別

注：1～5、10～14—供試品溶液B；6—淡豆豉對照藥材；7—淡豆豉陰性溶液；8—荊芥穗陰性溶液；9—荊芥穗對照藥材。圖6 淡豆豉TLC鑒別(254 nm紫外光)Fig.6 Identification of Sojae Semen Praeparatum using TLC (254 nm ultraviolet light)

注：1～5、10～14—供試品溶液B；6—淡豆豉對照藥材； 7—淡豆豉陰性溶液；8—荊芥穗陰性溶液；9—荊芥穗對照藥材。 圖7 荊芥穗TLC鑒別Fig.7 Identification of Schizonepetae Spica using TLC

3 討論

通過對銀翹散各單味藥材的系列薄層鑒別探索，發現蘆根在各展開劑條件下斑點稀少，在紫外和可見光下，與銀翹散各部分供試品溶液無對應斑點；淡竹葉中與銀翹散供試品溶液有一對應斑點，但此成分不穩定，放置1 h后，此斑點消失；桔梗與銀翹散供試品溶液有對應斑點，但陰性對照的干擾較大。因此在對銀翹散進行薄層鑒別時，只保留了金銀花、連翹、牛蒡子、薄荷、甘草、淡豆豉、荊芥穗等7味藥材的鑒別方法。

本文采用系列薄層色譜法對銀翹散樣品進行系統提取，一次制備得到三個不同極性部位的供試品溶液，同法制備各單味藥陰性對照溶液；所有對照藥材溶液均采用甲醇浸泡過夜方法制備，操作非常簡單。然后對不同極性部位的供試品、陰性對照、對照藥材溶液進行展開，找出適合鑒別該藥材的供試品溶液，建立該藥材的薄層鑒別方法；并且實現了一塊薄層板、一次展開即可分別對牛蒡子與甘草、淡豆豉與荊芥穗進行共同鑒別。而傳統薄層鑒別中[6-8]，需要對中藥復方制劑中每一味藥材都建立一種供試品處理方法和一種展開條件，相比之下，本方法不僅節省了大量的供試品處理時間，且僅使用對照藥材作為對照，節省了中藥生產企業大量的檢測成本，具有可操作性強、檢測成本低、方法簡單等優點。

本文建立的銀翹散中金銀花、連翹、牛蒡子、薄荷、甘草、淡豆豉、荊芥穗等7味藥材定性鑒別方法，找到了各單味藥的專屬斑點，斑點對應一致、清晰，Rf值適中，且陰性無干擾。此方法簡單快捷、重復性良好、可行性強，可以快速有效地鑒別銀翹散中7味藥材，為《中國藥典》中銀翹散薄層鑒別內容補充和質量標準提升提供了實驗依據，也為其他銀翹散成方制劑的TLC鑒別提供了參考。