基于網絡藥理學探討金蕎麥抗呼吸道合胞病毒作用機制

杜海濤，王平，李娜，韓莉，丁潔，胡亞楠

(1. 山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014； 2. 山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；3.天津大學 精密測試技術及儀器國家重點實驗室，天津 300072)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是世界范圍內嬰幼兒下呼吸道感染的主要原因，每年致55 000至199 000例兒童死亡[1-2]。由于感染后不會形成特異性免疫，患者愈后有再次感染的風險[3-4]。目前尚無特異性藥物，疫苗研發進程緩慢[5]。中藥在預防和治療病毒感染性疾病方面有著悠久歷史和豐富經驗，通過作用于多層次的免疫功能，恢復機體環境的穩定與平衡，在體內外治療中均表現出獨特優勢，開發應用前景廣闊。

金蕎麥為蓼科植物Fagopyrumdibotrys(D.Don) Hara的干燥根莖，又稱野蕎麥、金鎖銀開、赤地利等，歸肺經，有清熱解毒之功效，主治肺熱咳喘、肺癰、咽喉腫痛等[6]。現代藥理學研究表明，金蕎麥根莖中含有多種化合物，包括黃酮類、萜類、甾體及鞣質等，多具有抗病毒、抗炎以及增強免疫等作用，但尚未闡明其藥理作用機制[7-8]。

網絡藥理學融合生物信息學、系統生物學及網絡分析等方法，探索生物實體之間潛在的作用關系[9-10]，其整體思路與中醫藥整體觀念相一致，可以應用于解決中藥多成分、多靶點、協同作用等特點帶來的研究難題[11-12]。本研究在分子網絡調控的層面對金蕎麥主要藥效成分進行計算機虛擬篩選，探索中藥金蕎麥抗RSV的整體作用機制，以期初步揭示金蕎麥治療RSV肺炎的藥效基礎，為更好地開發抗病毒藥物提供參考依據。

1 方法

1.1 數據來源

本研究中采用的數據庫和分析軟件如下： TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；Open Babel (http://openbabel.org/wiki/Main_Page)；SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)；GeneCards (http://www.genecards.org/)； PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)；GenCLiP 3 (http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php)；NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；UniProt (http://www.uniprot.org/)； DAVID 6.8 (https://david.ncifcrf.gov/)； KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)；STRING (https://string-db.org/)；Cytoscape 3.7.1 (https://cytoscape.org/)； GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)；R Studio (https://rstudio.com/)；RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)；PyMol 2.3.0(https://pymol.org/)； AutoDock Tools 1.5.6(http://mgltools.scripps.edu/)； Vina(http://vina.scripps.edu/)； Python 3.7(https://www.python.org/)。

1.2 金蕎麥化學成分的獲取及靶點預測

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)是一個用于中藥的系統級藥理學數據庫，收納了藥典499種中草藥的化學成分、ADME參數等信息[13]。以“金蕎麥”為關鍵字，獲取TCMSP數據庫中該項下所有成分數據，根據引文方法對其靶點進行進一步活性成分篩選[14]。將收集的化學成分逐一傳至Open Babel，將化合物結構轉化為SMILES并導入到SwissTargetPrediction數據庫，將化合物與數據庫中靶點進行模擬對接，選取結果Probability>0的靶點[15]。

1.3 金蕎麥作用靶點預測及RSV相關疾病靶點檢索分析

以“Respiratory Syncytial Virus”作為關鍵詞，通過GeneCards數據庫查找和GenCLiP 3、NCBI文獻檢索，獲取RSV感染后關聯靶點，刪除重復值建立RSV疾病靶點數據庫。將化合物成分及靶點導入Cytoscape 3.7.1進行可視化，生成金蕎麥抗RSV成分-靶點網絡圖，使用Network analyzer 插件分析網絡特征靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用及KEGG通路富集分析

使用STRING平臺獲取靶標蛋白質-蛋白質相互作用( protein-protein interaction，PPI)關系[16]。將金蕎麥抗RSV潛在靶點蛋白名輸入設置隱藏無關聯靶點，構建PPI網絡導入Cytoscape 3.7.1，用Network analyzer 插件分析網絡特征靶點[17]，以節點度值(degree)評價節點的重要程度[18]。將網絡中大于2倍平均度值的節點定義為金蕎麥抗RSV的核心靶點[19]。

將RSV疾病靶點基因名用UniProt數據庫轉換為Uniprot ID。在DAVID 6.8平臺對金蕎麥抗RSV核心靶點可能KEGG通路進行富集分析，選擇差異性具有統計學意義(P<0.01)的條目，得到關鍵核心靶標參與的通路信息。將核心蛋白UniProt ID 輸入KEGG平臺，得到每條通路的信息圖，整合后繪制金蕎麥核心靶點信號通路圖。

1.5 GEO芯片數據分析核心靶點

從GEO數據庫檢索并下載編號為GSE32138的芯片數據原始文件，該芯片收集了人氣道上皮細胞對RSV感染的反應，包含4例經RSV感染2 h后模型組和4例對照組細胞的測序信息[20]。使用Benjamini&Hochberg算法對P值進行校正并篩選的差異基因[21]。使用R Studio將數據進行可視化，使用差異表達基因數據繪制火山圖，篩選得到的核心靶點繪制熱圖。

1.6 分子對接

為了進一步驗證篩選出的活性成分及核心靶點，將1.4項下金蕎麥核心靶點信號通路圖中的關鍵化合物與核心作用靶點及RSV結構靶點進行分子對接。從PBD數據庫下載靶蛋白的高分辨三維晶體結構，使用PyMol 2.3.0 和Autodock Tools 1.5.6 進行分子前處理，保存為*.pdbqt格式文件。運行Python及Autodock Vina 進行批量半柔性分子對接，小分子輸出結果用PyMol2.3.0軟件可視化。

2 結果

2.1 金蕎麥活性成分及靶點預測結果

通過TCMSP數據庫檢索出金蕎麥的相關成分61個，經參數篩選出金蕎麥中15個潛在活性成分(表1)。通過 SwissTargetPrediction 數據庫獲得上述活性成分作用靶點209個；在平臺共檢索到RSV肺炎表型相關靶點共845個，整理合并得到金蕎麥體內抗RSV潛在相互作用靶點45個。

表1 金蕎麥潛在活性成分Table 1 Potential active ingredients of Fagopyri Dibotryis Rhizoma

2.2 構建化合物-靶點網絡

將篩選出的與RSV肺炎相關的靶點與成分建立關聯，導入Cytoscap3.7.1 中，合并成金蕎麥抗RSV成分-靶點相互作用關系，見圖1。該關系有205個節點，911條邊，可以看出同一靶點可對應不同活性成分，不同活性成分也對應多個靶點，充分體現了金蕎麥多成分、多靶點的作用特點。

圖1 金蕎麥抗RSV成分-靶點網絡圖Fig.1 Anti-RSV ingredient-target network diagram of Fagopyri Dibotryis Rhizoma

2.3 PPI及KEGG通路富集分析結果

金蕎麥抗RSV的核心靶點PPI網絡見圖2，該網絡有35個節點，97條邊，平均度值為5.543，大于2倍度值的AKT1、VEGFA、PTGS2、SRC、EGFR是該網絡的核心節點。對金蕎麥15個化合物預測的靶點使用DAVID 6.8進行KEGG通路富集分析(P<0.01)。富集得到金蕎麥抗RSV的30條主要通路，選取涉及抗病毒免疫的前6條通路將其結果可視化，可見金蕎麥抗病毒主要涉及VEGF信號通路、Rap1信號通路、PI3K-Akt信號通路等，指示金蕎麥可能通過這些通路發揮抗RSV作用，如圖3 所示。

注：代表靶點度值由低到高。圖2 金蕎麥抗RSV的PPI網絡 Fig.2 PPI network of Fagopyri Dibotryis Rhizoma against RSV

圖3 KEGG通路富集分析結果Fig.3 Results of KEGG pathway enrichment analysis

將圖3的6條金蕎麥抗RSV相關通路進行整合繪制主要靶點信號通路圖，由金蕎麥直接作用的靶點標記為紅色(圖4)。提示金蕎麥抗RSV靶點主要分散于這幾條通路中，通過調節其中的幾個關鍵靶點發揮作用，且多數靶點在多條通路中發揮作用，如VEGF、AKT等。在核心靶點中未出現的BCL2、STAT3和KDR也有多條通路涉及，可能在通路間起調控樞紐的作用。將2.3項下得到的核心成分及涉及的靶點、通路匯總得到核心成分-基因靶點-信號通路圖(圖5)，該網絡有24個節點、73條邊。從網絡中可以看出，金蕎麥多個有效成分能夠作用于多個靶點，這些靶點進一步調節核心信號通路，體現了金蕎麥多成分、多靶點整體調節的抗病毒作用機理。

圖4 核心靶點信號通路關聯圖Fig.4 Correlation diagram of core target signaling pathway

圖5 核心成分-靶點-信號通路圖Fig.5 Core ingredient-target-signaling pathway diagram

圖6 RSV感染相關芯片差異表達基因火山圖及差異表達基因的聚類熱圖Fig.6 Volcanic mapand cluster heatmap of differentially expressed genes related to RSV infection

2.4 候選靶點分析

對GEO芯片數據庫基因芯片的二次分析篩選獲得差異表達基因17 720個，篩選條件：P<0.01且Fold Change的絕對值>2，從結果中發現金蕎麥抗RSV核心靶點全部屬于有意義的差異表達基因。以芯片中各個核心靶點上下調表達情況繪制聚類熱圖，使用綠色代表下調基因，紅色代表上調基因，可以看出對照組和模型組在各自的組內能夠聚到一起，兩組之間具有明顯差異，該結果間接驗證了篩選出核心靶點的有效性。

2.5 分子對接

從RCSB PDB數據庫中共獲取了11個靶點蛋白，分別為RSV-G(6BLH)、RSV-F(5UDE)、RSV-L&P(6PZK)、SRC(2H8H)、PTGS2(5F19)、AKT1(1UNQ)、VEGFA(4ZFF)、EGFR(5WB7)、STAT1(3WWT)、KDR(3S35)與BCL2(5VAU)，其詳細信息見OSID。分子對接配體受體之間對接的結合能越低，發生作用的可能性就越大，以結合能≤-20.93 kJ/mol作為判定標準，小于此值說明配體具有潛在調節受體的活性。金蕎麥與靶點間的對接結合能見圖7，可以看出多數化合物與各靶點結合能達到標準，原花青素B1(MOL000004)，β-谷甾醇(MOL000358)等與各靶點間結合能總和絕對值較高，初步驗證了網絡藥理學預測結果的可靠性。圖8列出了前4位核心成分與靶蛋白的結合位置(A1-H1)與3D對接細節(B2-H2)。分子對接結果說明金蕎麥核心成分可能主要依靠直接抑制病毒RNA的復制、轉錄從而抑制病毒在體內的復制增殖(RSV-L&P)，控制免疫進程、細胞周期、凋亡、遷移(SRC)等過程發揮抗RSV作用。

注：單位kJ/mol。圖7 核心成分與靶點間的結合能熱圖Fig.7 Binding energy heatmap of core ingredients and targets

注：A為原花青素B1與RSV L&P蛋白，B為(-)-兒茶素沒食子酸酯與SRC，C為3,8-二羥基-10-甲氧基-5-h-異色烯[4,3-b]色烯-7-酮與SRC，D為β-谷甾醇與SRC，E為(-)-兒茶素沒食子酸酯與PTGS2，F為3,8-二羥基-10-甲氧基-5-h-異色烯[4,3-b]色烯-7-酮與PTGS2，G為原花青素B1與EGFR，H為β-谷甾醇與BCL2；3D關系中，藍色實線代表氫鍵相互作用，灰色虛線代表疏水相互作用，黃色虛線代表鹽橋，綠色虛線代表π-π垂直堆疊。圖8 關鍵成分靶點分子對接模式圖Fig.8 Molecular docking pattern diagram of key ingredients and targets

3 討論

金蕎麥歸肺經，為清熱解毒要藥，溫病名家吳鞠通指出“治上焦如羽，非輕不舉”，意在藥取辛涼，開已閉之肺，清解風熱時邪。其主要成分黃酮、甾體、有機酸等具有抗多種病毒潛力。據核心成分-靶點-信號通路圖顯示，金蕎麥的多種成分可作用于多個靶點，最終通過多條通路起抗RSV作用。其中，黃酮占金蕎麥有效成分的33.3%，能夠直接作用于多個RSV結構蛋白和體內核心靶點。黃酮類組分能夠與病毒多個結構蛋白直接結合，具有直接控制病毒復制的潛力，具有進一步開發的價值[22]。因此，我們推測金蕎麥發揮抗RSV最主要的成分為黃酮類組分。

通過基因芯片結果的二次分析可以發現，氣道上皮細胞在RSV入侵后的2 h即可做出大量的應答，差異表達基因高達17 720個，部分基因差異倍數較高。金蕎麥涉及的關鍵靶點上游基因均屬于差異基因，參與對病毒感染后體內環境的調節。從PPI網絡可以看出，SRC、PTGS2、AKT1、VEGFA、EGFR五個靶點蛋白處于網絡中心，節點度值高，是金蕎麥體內發揮抗病毒功效的核心靶點。KEGG靶點通路富集分析結果表明，金蕎麥體內抗RSV涉及30條信號通路，多條與免疫、抗病毒直接相關，是一個復雜的過程。靶點通路分析結果顯示，BCL2、STAT3和KDR是重要的樞紐。即金蕎麥抗RSV的靶點主要涉及AKT1、VEGFA、PTGS2、SRC、EGFR、KDR、STAT3、BCL2等。其中，SRC是一種酪氨酸的轉移性蛋白激酶，廣泛存在于各種細胞質中，在病毒感染過程中發揮著重要作用[23]。研究表明，SRC族激酶通過多種機制參與病原微生物的感染過程(如與病原微生物的脯氨酸基序-PXXP互作)[24]。鄭剛[25]發現SRC同源酶可促進α-干擾素誘導的Jak/Stat1信號通路，從而抑制RSV復制。分子對接結果顯示SRC與金蕎麥各個核心成分結合力最強，推測是體內通過免疫途徑發揮抗病毒作用的關鍵途徑。KDR是血管內皮生長因子(VEGF)的重要受體之一，結合后可促進內皮細胞分裂、增殖、遷移、加速血管新生。有研究發現病毒侵染后，KDR導致特異性CD8+T細胞激活，導致細胞形態變化，促使細胞增殖和膜通透性增加，可能是后期增強免疫的途徑之一[26]。STAT家族蛋白具有廣泛的生物學作用，抑制腫瘤生長、促進腫瘤細胞的凋亡、參與固有免疫反應等。STAT在Jak-1和Tyk-2的催化作用下發生磷酸化, Jak-1和Jak-2刺激磷酸化的STAT形成二聚體，并轉移至細胞核內，激活抗病毒啟動子，介導IFN途徑的免疫[27]。STAT1可通過乙酰化、泛素化、甲基化等不同修飾影響干擾素抑制病毒復制[28]。BCL2是線粒體介導的凋亡過程的關鍵信號因子。Kvansakul等[29]研究發現多種病毒通過調節BCL的同源物以阻斷宿主細胞的凋亡和自噬，防止感染細胞過早死亡。該研究提示可從調控細胞凋亡過程入手，阻止病毒在細胞中過度復制。PI3K和AKT參與維持RSV感染過程中細胞活力。PI3K及其下游介質在氣道上皮細胞RSV感染過程中，在誘導凋亡和炎癥中起重要作用[30]。Monick等[31]研究證明，阻斷AKT活化會導致RSV感染的細胞加速凋亡。因此抑制PI3K和AKT過程可能是金蕎麥發揮抗RSV感染的途徑之一。EGFR可參與上皮細胞的生長、修復和瘤變, 在黏蛋白的分泌、細胞間緊密連接的調控中起重要作用，活化后可抑制氣道上皮細胞的抗病毒防御功能[32-33]。劉娟娟等[34]發現RSV可致EGFR活化，促進IL-8釋放并抑制細胞凋亡，提示抑制EGFR的活化是降低RSV感染程度的方法。

綜上所述，金蕎麥抗RSV的15個潛在活性成分直接作用于45個體內靶點與3個病毒結構蛋白靶點，涉及多個基因、蛋白和通路，體現了金蕎麥多成分-多靶點-多途徑的作用特點，本文還對作用的主要途徑繪制了關鍵靶點通路簡圖，并通過GEO數據挖掘和分子對接初步驗證了核心靶標在PPI 及通路中的樞紐作用，對金蕎麥抗病毒機制的進一步研究提供了方向，上述結果與文獻報道靶點基本一致。

網絡藥理學能較好地體現大數據時代生物醫藥衛生系統性研究的新方向與新趨勢，也能適應中醫藥現代化過程中對研究技術方法的迫切要求。隨著多組學以及高通量技術的發展，從整體角度出發，多層次手段挖掘、整合疾病的分子機制與藥物作用機制，必將會為金蕎麥的現代化開發和應用提供新的思路。