鈣指示劑修飾電極同時(shí)測(cè)定嘌呤和嘧啶

劉小嫻

(南通市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇 南通 226600)

脫氧核糖核酸(DNA)作為一個(gè)重要的生物大分子近幾年來(lái)備受關(guān)注。它不僅能夠遺傳信息，而且其雙螺旋結(jié)構(gòu)可以提供一個(gè)有效的媒介來(lái)供電子轉(zhuǎn)移[1-3]，因此為DNA的檢測(cè)提供了一個(gè)敏感的，準(zhǔn)確的，快速的和具有成本效益的平臺(tái)，在各種實(shí)際應(yīng)用、醫(yī)療領(lǐng)域中的診斷、臨床遺傳分析、法醫(yī)鑒定和環(huán)境監(jiān)測(cè)中具有深刻的意義[4-6]。

迄今為止，人們已經(jīng)提出了很多化學(xué)方法來(lái)檢測(cè)DNA中的嘌呤成分(鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤等)，如質(zhì)譜法(MS)，高效液相色譜法(HPLC)，離子對(duì)液相色譜法(IPIC)，毛細(xì)管電泳法(CE)，流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法(CL)和光譜法等，但是這些方法中存在著很多的不足：耗時(shí)，儀器昂貴，靈敏度低，預(yù)處理復(fù)雜等。相比較之下，電化學(xué)的檢測(cè)方法更為簡(jiǎn)單、方便、快捷。

鈣指示劑(又稱鉻藍(lán)黑R)是一種偶氮染料。據(jù)我們所知，有關(guān)鈣指示劑的電聚合和應(yīng)用的文獻(xiàn)很少。本文研究了鈣指示劑的電聚合以及其在嘌呤和嘧啶測(cè)定上的應(yīng)用。應(yīng)用了場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FESEM)對(duì)電極表面的聚鈣指示劑膜進(jìn)行了表征。基于聚鈣指示劑膜修飾玻碳電極對(duì)鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的不同電催化活性，建立了能同時(shí)測(cè)定嘌呤和嘧啶的靈敏度高、選擇性好的電化學(xué)方法，并成功用于DNA樣品的檢測(cè)中，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

DNA Calf Thymus(Sigma)，鳥(niǎo)嘌呤(guanine)、腺嘌呤(adenine)、胸腺嘧啶(thymine)、胞嘧啶(cytosine)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鈣指示劑，中國(guó)上海化學(xué)試劑公司；CHI電化學(xué)工作站660D，上海辰華儀器公司；S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，Hitachi，日本。

1.2 DNA樣品的制備

根據(jù)之前的報(bào)道[7]，稱取鮭魚(yú)精DNA 12.0 mg，加入600 μL甲酸88%(w/w)在封閉的試管中于170 ℃下加熱30 min。水解產(chǎn)物用2.0 M NaOH溶液調(diào)節(jié)到中性，然后用蒸餾水稀釋。即得到DNA樣品。

1.3 鈣指示劑修飾玻碳電極的制備

將預(yù)處理好的玻碳電極再置于含25 mmol/L鈣指示劑磷酸鹽緩沖溶液中(pH=5.0)中，于-0.8～+1.4 V范圍內(nèi)，以 100 mV/s的掃描速度循環(huán)掃描5圈，即可制得聚鈣指示劑膜修飾電極。

2 結(jié)果與討論

2.1 鈣指示劑聚合的循環(huán)伏安曲線

圖1為鈣指示劑在以0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH=5.0)為介質(zhì)，于-0.8～+1.4 V電位范圍內(nèi)，在100 mV·s-1掃速條件下電聚合5圈最佳聚合條件下的循環(huán)伏安曲線圖。從圖中可以看出，第一圈循環(huán)伏安曲線掃描時(shí)在0.189 V出現(xiàn)一很強(qiáng)的氧化峰，從第二圈開(kāi)始，氧化峰電流開(kāi)始減少，5圈后達(dá)到穩(wěn)定。這一現(xiàn)象表明，聚鈣指示劑膜已被聚合到玻碳電極的表面。

掃描電位：-0.8～+1.4 V；掃描速率：100 mV/s；掃描圈數(shù)：5圈

2.2 修飾電極的電化學(xué)表征

圖2是聚鈣指示劑膜修飾電極的掃描電鏡圖。從圖中可以看出，聚合后電極表面形成了一層褶皺狀的膜，說(shuō)明鈣指示劑已經(jīng)聚合到電極表面。

圖2 聚鈣指示劑膜修飾電極和裸電極的掃描電鏡圖

2.3 G， A， T， C在鈣指示劑修飾電極上的電化學(xué)行為

圖3研究了含有50 μM嘌呤和100 μM嘧啶的PBS(pH 6.0)混合溶液在裸電極和鈣指示劑修飾電極上的電化學(xué)氧化行為。曲線a顯示了裸電極測(cè)定時(shí)兩個(gè)弱而寬的氧化峰，G和A的電位分別在0.688 V，0.988 V左右。由于電子轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)的改善，曲線b中氧化電流增加到1.5倍左右，并且G和A，A和T，T和C之間的峰間距分別為296 mV，184 mV，152 mV，四個(gè)物質(zhì)的氧化峰得到很好的分離。

圖3 50 μM G(A)，50 μM A(B)，100 μM T (C)，100 μM C (D)，50 μM G，A 和100 μM T，C混合溶液(E)在pH值為6.0 PBS中的裸電極(a)和聚鈣指示劑膜修飾電極(b)上的示差脈沖伏安圖

2.4 測(cè)定底液的選擇

考察了鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶在不同的支持電解質(zhì)中如HCl，H2SO4和不同的緩沖溶液中(HAc-NaAc， KCl， NH4Cl-NH3·H2O)的示差脈沖伏安圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶在磷酸緩沖溶液溶液中可以得到最靈敏和峰型最好的電流響應(yīng)圖。因此，本實(shí)驗(yàn)選用磷酸緩沖溶液為測(cè)定底液。

2.5 底液pH的影響

以PBS為底液，在pH 2.0～9.0的范圍內(nèi)，底液的pH值不僅改變G的氧化峰電流，而且改變其氧化峰電位。G和A的氧化峰電流在pH=3.0時(shí)達(dá)到最大，T和C在8.0和6.0左右達(dá)到最大。綜合考慮，因此選擇pH=6.0的PBS作為同時(shí)測(cè)定這四種物質(zhì)的底液。

2.6 掃速的影響

通過(guò)循環(huán)伏安曲線考察了50 μM G，A 和 100 μM T ，C的峰電流跟掃描速度的關(guān)系。在10～300 mV·s-1的范圍內(nèi)，G峰電流與掃描速度的平方根成正比，其線性回歸方程為I(μA)=0.4457v1/2(mV/s)+0.1759，(r=0.9954)，表明G在修飾電極上受擴(kuò)散控制的過(guò)程。A，T和C的峰電流同樣都與掃描速度的平方根成正比，其線性回歸方程分別為：I(μA)=0.4705v1/2(mV/s)-0.7035，(r=0.9949)；I(μA)=0.1155v1/2(mV/s)+0.2348，(r=0.9969)； I(μA)=0.2926v1/2(mV/s)-0.4960， (r=0.9983)。表明A，T和C在修飾電極上也都是受擴(kuò)散控制的。

G concentrations (from 1 to 10)：1.5， 3， 7.5， 17.5， 25， 40，50， 60，70 and 80 μM. A concentrations (from 1 to 10)： 1， 5， 20， 35， 40， 50，60，70， 80 and 90 μM. T concentrations(from 1 to 10)： 1.5， 5， 10，30， 50， 85， 100， 150， 180 and 200 μM. C concentrations (from 1 to 11)：1.5， 5， 10， 20， 30， 40， 50， 60， 70 and 80 μM

2.7 線性范圍及檢出限

鈣指示劑修飾電極能夠很好地用于混合溶液中鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶含量的同時(shí)測(cè)定。鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰電位分別為0.680 V，0.964 V，1.176 V和1.308 V。圖4表示了0.1 M pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液中不同濃度的鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶共存時(shí)用示差脈沖伏安法測(cè)得的曲線，曲線表示隨著濃度的增加，鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化信號(hào)不斷增強(qiáng)。另外，鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的電化學(xué)信號(hào)所對(duì)應(yīng)的氧化峰電位之間的間隔為296 mV，184 mV和152 mV，足夠用于它們的同時(shí)測(cè)定。鳥(niǎo)嘌呤的氧化峰電流和濃度在3～80 μM范圍內(nèi)呈比例關(guān)系，線性回歸方程為：ip(10-6A)=3.1946+0.0535 C(10-6mol·L-1),R=0.9855。通過(guò)計(jì)算，得出檢測(cè)限為0.5 μM (S/N=3)。對(duì)于腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量測(cè)定，方法情況和鳥(niǎo)嘌呤相似，氧化峰電流和濃度之間的線性關(guān)系如表1。

表1 利用示差脈沖伏安法測(cè)定DNA堿基的線性方程

2.8 干擾實(shí)驗(yàn)

在5%的誤差范圍內(nèi)，在含有50 μM鳥(niǎo)嘌呤，50 μM腺嘌呤，100 μM胞嘧啶和100 μM胸腺嘧啶的緩沖溶液中，加入葡萄糖，維生素C，甘氨酸等均無(wú)干擾。這表明鈣指示劑修飾電極能夠有效地排除一般存在的干擾物對(duì)鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，胞嘧啶和胸腺嘧啶測(cè)定的影響。

3 重復(fù)性和穩(wěn)定性

用同一支玻碳電極在相同條件下用鈣指示劑修飾4次，然后在0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖(PBS)中對(duì)鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶進(jìn)行測(cè)定；再用同一支修飾電極在0.1 mol·L-1PBS中平行測(cè)定5次，其RSD分別為1.45%，2.32%，3.7%和3.4%。表明該修飾電極的重現(xiàn)性令人滿意。將該修飾電極在室溫放置，一周后測(cè)定其響應(yīng)電流變?yōu)樵瓉?lái)的90%，表明該修飾電極的穩(wěn)定性可以滿足實(shí)際應(yīng)用的需求。

4 DNA樣品測(cè)定

用鈣指示劑修飾電極來(lái)檢測(cè)鮭魚(yú)精DNA中鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的濃度。根據(jù)氧化峰電流計(jì)算可知，鮭魚(yú)精DNA中鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量分別為40.00， 55.00， 72.50和65.70。因此，計(jì)算熱變性DNA中(G+C)/(A+T)的值為0.83，接近于標(biāo)準(zhǔn)值0.79。

5 結(jié) 論

通過(guò)電化學(xué)修飾電極的方法制備了一種新型的聚鈣指示劑膜電極，本實(shí)驗(yàn)采用示差脈沖扣除背景法，利用此修飾電極同時(shí)測(cè)定了鳥(niǎo)嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該修飾電極對(duì)嘌呤和嘧啶有氧化催化作用，應(yīng)用本法對(duì)鮭魚(yú)精DNA樣品進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果令人滿意。