HPLC法同時測定不同產(chǎn)地番紅花中4種化合物的含量*

尚嚴(yán)嚴(yán)，李東林

(阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 阜陽 236031)

番紅花(學(xué)名：CrocussativusL.)又名藏紅花、西紅花，以其干燥柱頭入藥，是亞洲西南部原生種，最早在希臘人工栽培。主要分布?xì)W洲、地中海及中亞等地，是一種名貴的中藥材[1-2]。明朝傳入我國，該藥具有散瘀止痛、活血化瘀，散濕去腫之功效，主要用于治經(jīng)閉、痛經(jīng)、胸脅刺痛、跌打損傷、瘡瘍腫痛等癥[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，番紅花的特征性成分主要是西紅花苷、苦番紅花素、西紅花酸[4-5]。其中，西紅花苷具有抗氧化、降血壓、降血脂等作用；苦番紅花素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用；西紅花酸對心臟、保護海馬神經(jīng)元等有保護作用[6-10]。然而因種植方法、種植區(qū)、氣候條件等不同，不同產(chǎn)地番紅花中藥效物質(zhì)基礎(chǔ)存在一定的差異[11]。2020版《中國藥典》僅以西紅花苷和苦番紅花素為指標(biāo)成分來評價番紅花藥材質(zhì)量，相對單一的檢測指標(biāo)對番紅花的質(zhì)量評價存在一定的缺陷[12]。筆者此次收集了不同產(chǎn)區(qū)18批番紅花，結(jié)合《中國藥典》擬建立HPLC法測定番紅花中西紅花苷-I、西紅花苷-II、苦番紅花素、西紅花酸4種功效物質(zhì)的含量，以期為番紅花在皖北合理“安家”提供定性、定量指標(biāo)，為番紅花規(guī)范化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器與試藥

安捷倫1260型高效液相色譜儀；十萬分之一天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DL-60J智能臺式超聲波清洗機，上海之信儀器有限公司；西紅花苷-I(批號：P0187，純度≥98%)，上海純優(yōu)生物科技有限公司;西紅花苷-II(批號：JW10503，純度≥98%)，上海極威生物科技有限公司;西紅花酸(批號：DX0041，純度≥98%)，成都德思特生物技術(shù)有限公司;苦番紅花素(批號：JOT-11341，純度≥98%)，成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙腈、甲醇色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 供試樣品

番紅花樣品購自安徽省阜陽市阜南縣番紅花種植專業(yè)合作社(編號：FN-1、FN-2、FN-3、FN-4、FN-5、FN-6)、安徽省亳州市譙城區(qū)番紅花種植戶(編號：BQ-1、BQ-2、BQ-3、BQ-4、BQ-5、BQ-6)和浙江建德(編號：ZJ-1、ZJ-2、ZJ-3、ZJ-4、ZJ-5、ZJ-6)。18批番紅花樣品均經(jīng)阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院李東林教授鑒定為鳶尾科植物番紅花(CrocussativusL.)的干燥柱頭。

2 方 法

2.1 色譜條件

島津C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(含0.1%甲酸)，流速1.0 mL/min；檢測波長為：250 nm、430 nm(0.00～15 min，430 nm；15.01～20.00，250 nm；20.01～50.00，430 nm)；柱溫為30 ℃，進樣量：10 μL，梯度洗脫。

表1 色譜條件

圖1 高效液相色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

取西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素對照品適量，精密稱定，分別置100 mL量瓶中，加弱堿性稀乙醇50 mL溶解，冰浴超聲(功率200 W，頻率40 kHz)10 min，提取2次，放置室溫，弱堿性乙醇定容，依次得濃度為518.1、326.4、181.36、590.4 μg/mL的母液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品(編號：FN-1)適量，打成細(xì)粉，過篩，稱取 20 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加弱堿性稀乙醇50 mL溶解，冰浴超聲(功率200 W，頻率40 kHz)10 min，提取 2次，放置室溫，弱堿性乙醇定容，搖勻，濾過，即得續(xù)濾液。

2.4 線性范圍的考察

分別移取各母液各0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mL，精密量取，分別置于10 mL量瓶中，加弱堿性稀乙醇溶液至刻度，搖勻，在“2.1”項色譜條件下測定。以西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo) X，以峰面積為縱坐標(biāo) Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程及線性范圍見 表2所示。結(jié)果表明，4種化合物在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 線性關(guān)系考察

2.5 精密度試驗

2.5.1 不同日期精密度試驗

取同一對照品，在不同日期，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣 6 次，分別測得西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素峰面積的RSD分別為 0.53%、0.77%、1.12%、0.68%，表明該方法的中間精密度良好。

2.5.2 不同儀器精密度試驗

取同一對照品，在不同儀器上，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣 6 次，分別測得西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素峰面積的RSD分別為 0.65%、0.82%、1.23%、0.93%，表明該方法的中間精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取樣品(編號：FN-1)適量，稱取樣品20 mg，共6 份，精密稱定，按“2.3” 項下制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下測定峰面積，計算西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素平均含量依次是：13.44%、5.81%、1.5%、8.69%；西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素RSD值分別為：1.15%、1.66%、2.19%、2.29%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取供試品(編號：FN-1)溶液，分別于 0、1、4、6、8、12、20 h 進樣，記錄峰面積，計算RSD值。結(jié)果顯示，西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素峰面積的RSD分別為1.19%、0.91%、0.87%、1.03%，表明供試品溶液室溫避光保存20h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的番紅花樣品(編號：FN-1)，稱取10 mg，共 6 份，精密稱定，置于100 mL量瓶中，分別加入西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素對照品適量，按“2.3”項下制備供試品溶液，在色譜條件下測定，計算加樣回收率。4種化合物的平均加樣回收率及RSD值見表3所示。

表3 4種化合物的加樣回收率試驗(n=6)

2.9 樣品含量測定

取收集的18批番紅花樣品，分別稱取粉末約20 mg，精密稱定，按對應(yīng)方法操作，制備番紅花供試品溶液，在色譜條件下測定，測定結(jié)果見表4所示。

表4 樣品含量測定結(jié)果(n =3)

續(xù)表4

3 結(jié)果與討論

3.1 提取方式考察

通過借鑒朱亞楠等[13]提取西紅花中有效成分的方法，并在此基礎(chǔ)之上進行優(yōu)化，具體如下：因4種目標(biāo)成分是在同一條件下提取，西紅花苷類物質(zhì)中含有酯鍵，在溫度稍高、超聲時間稍長時，則已發(fā)生水解，致使目標(biāo)成分含量減少，測量數(shù)據(jù)誤差增加；西紅花酸在2020版《中國藥典》條件下溶解性較差，可使其成鹽達(dá)到增加溶解度目的，使用弱堿性稀乙醇溶液則可事半功倍，故本次試驗在低溫、超聲10 min時，可以達(dá)到提取目標(biāo)成分真實含量的目的。

3.2 色譜條件考察

通過對乙腈-水、甲醇-水、甲醇-甲酸溶液等多個流動相體系進行摸索比較[14-16]，乙腈-水作為流動相，西紅花酸與相鄰雜質(zhì)峰之間分離度小于1.5，且乙腈價格較高毒性較大。甲醇-水作為流動相，基線不夠平穩(wěn)，出峰時間較晚。故選擇甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動相，基線平穩(wěn)，理論塔板數(shù)大于10231，四種成分的分離度大于2.5，峰形對稱性較好，可用于目標(biāo)成分的分離與檢測。

3.3 結(jié)果分析

為便于直觀反映表4不同產(chǎn)地番紅花中4種有效物質(zhì)的含量，采取繪制坐標(biāo)圖的方式進行展示，見圖2。

圖2 不同產(chǎn)地番紅花中4種有效物質(zhì)的含量

由圖2，對比不同產(chǎn)地番紅花中4種有效物質(zhì)的含量，西紅花苷-I和苦番紅花素含量最高，其次為西紅花苷-II，最低為西紅花酸。其中，各批番紅花中西紅花苷-I和西紅花苷-II含量之和均超過18%、苦番紅花素的含量均超過8.0%，達(dá)到2020版《中國藥典》規(guī)定要求[12]。

阜南產(chǎn)番紅花(編號FN-1、FN-2、FN-3)中4種功效化合物含量稍低于其它產(chǎn)地，可能與采收的是一年生番紅花有關(guān)。此試驗排除不同生長年份對番紅花中有效物質(zhì)含量的影響，阜南產(chǎn)(編號FN-4、FN-5、FN-6)藥材較少，故本次僅對安徽亳州和浙江建德產(chǎn)番紅花進行結(jié)果分析。

安徽亳州產(chǎn)番紅花中4種功效化合物的含量整體高于浙江建德。經(jīng)多次實地考察，發(fā)現(xiàn)番紅花的品質(zhì)受種植方式、土壤條件、田間肥力、溫濕度、降水量等的影響。

浙江建德采取室內(nèi)外“二段式”種植模式，番紅花柱頭在室內(nèi)采收后，種球于11月中下旬栽種于大田，室外生長6個月左右，次年5月地上部分干枯挖出種球，置陰涼通風(fēng)處貯藏[17]。而安徽亳州采取室外“一段式”種植模式，即當(dāng)年5月份種球不挖出，套種其它農(nóng)作物遮陰使種球在地下渡過休眠期，開花期在田間采收柱頭。從采摘后的柱頭品相觀察，建德產(chǎn)番紅花優(yōu)于亳州。但通過本實驗，結(jié)合前人研究[18]數(shù)據(jù)分析，亳州產(chǎn)番紅花中有效成分的含量高于浙江建德。結(jié)果表明，“一段式”和“二段式”種植模式對番紅花中有效成分的積累影響不大，且“二段式”生產(chǎn)成本較高，生產(chǎn)上要因地制宜，綜合考慮生長環(huán)境、品種、勞動力資源和經(jīng)濟情況確定適宜生產(chǎn)模式。

從種植土壤環(huán)境分析，浙江建德土質(zhì)黏重，板結(jié)不透氣；亳州土壤質(zhì)地含砂量高，疏松透氣，不易積水。李明林等[19]研究表明，砂質(zhì)土壤更適宜西紅花種球的生長，有利于營養(yǎng)成分的積累。

亳州產(chǎn)番紅花在種植過程中，多施用有機肥，有機肥中含有大量的有機物質(zhì)和有益菌，能提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，有效改善土壤理化性質(zhì)。

番紅花田間生長忌水澇，浙江建德地處亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，夏季降雨充沛，溫濕度較高，易致室外田間種球腐爛，室內(nèi)采摘后的番紅花中有效成分含量下降；安徽亳州氣候處在暖溫帶南緣，氣候溫和，光照充足，雨量適中，有利于番紅花種球在大田生長。

除上述因素外，如病蟲害防治、鮮品加工方式、貯藏都會使番紅花有效成分含量發(fā)生變化，相關(guān)影響因子和效應(yīng)還需要進一步深入研究，以期為番紅花在皖北地區(qū)規(guī)范化種植提供理論支撐。

此次試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)西紅花酸的含量在不同產(chǎn)地之間差異不明顯，可能和本次試驗樣本量少有關(guān)，要使試驗結(jié)果更準(zhǔn)確可靠，需要收集更多數(shù)量番紅花藥材樣本，測定番紅花中4種功效化合物的含量才更具有地域代表性。

4 結(jié) 論

本文采用HPLC法同時測定不同產(chǎn)地番紅花藥材中4種藥效化合物的含量，該方法簡便、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，可用于番紅花的質(zhì)量控制和評價。

目前，HPLC法測定番紅花中有效成分含量的研究多集中在不同產(chǎn)地之間的比較以及不同部位之間的比較[14，16，18]，而對其不同生長年份以及不同花期階段中化學(xué)成分含量變化關(guān)注較少，為提高番紅花的質(zhì)量，應(yīng)更加關(guān)注番紅花生長年限以及花期階段中化學(xué)成分含量的變化，為確定最佳采收時間提供依據(jù)。

通過本次試驗，可以進一步結(jié)合不同產(chǎn)地番紅花指紋圖譜的構(gòu)建，來檢測番紅花中有效成分的種類與數(shù)量，從而更全面評價皖北地區(qū)番紅花的質(zhì)量，最終為番紅花在皖北擴大生產(chǎn)規(guī)模，為全面促進鄉(xiāng)村振興和農(nóng)戶創(chuàng)業(yè)增收奠定基礎(chǔ)。