高效液相色譜法測定注射用左亞葉酸鈉有關物質的研究

姜海兵，邱 文

(深圳市資福藥業有限公司，廣東 深圳 518120)

亞葉酸鈉與5-氟尿嘧啶合用治療胃癌和結直腸癌。亞葉酸是四氫葉酸(THF)的5-甲酰衍生物的非對映異構體混合物，其生物活性物質為左旋體稱為左亞葉酸[1]。本文經試驗研究采用HPLC法測定有關物質，重復性好，結果準確可靠[2-5]。

1 儀器和試藥

1.1 儀 器

美國Thermo U3000高效液相色譜儀，包括U3000四元泵，U3000紫外檢測器，U3000柱溫箱和U3000自動進樣器，變色龍工作站

1.2 試 藥

試藥：注射用左亞葉酸鈉(規格：50 mg/瓶(以左亞葉酸計)，批號121001、121002、121003,深圳市資福藥業有限公司;亞葉酸鈣對照品：中檢所，批號：100252-200703，100252-200403;10-甲酰葉酸(EP標準品);甲醇、乙腈：色譜純，天津四友，Honey well;其余試劑均為分析純，廣州化學試劑廠，天津大茂化學試劑廠。

2 試驗方法和結果

2.1 溶液配制

取本品適量，加流動相制成每1 mL中約含1 mg的溶液濾過，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液；

精密量取1 mL供試品溶液，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液(1)；

取10-甲酰葉酸對照品適量，置25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液儲備液，精密量取1 mL對照品溶液儲備液，置50 mL量瓶中，加流動相制成每1 mL含8 μg的溶液，作為對照液(2)。

2.2 液相色譜條件選擇

2.2.1 流動相及色譜柱選擇

流動相：10%四丁基氫氧化銨-甲醇-乙腈-水(37.5:15:190:750)用磷酸調節pH值至7.5±0.1。

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的液相色譜柱；本實驗使用Kromasil，C18柱，5 μm，250 mm×4.6 mm。

2.2.2 檢測波長的選擇

按2.1制備供試液，按上述色譜條件進樣，在190～900 nm進行全波長掃描，記錄吸收圖譜，結果表明在該色譜條件下，左亞葉酸及其有關物質在280 nm下有較好的吸收，因此優選280 nm作為有關物質測定波長。

2.3 專屬性試驗

2.3.1 已知雜質試驗

精密稱取左亞葉酸鈉凍干粉及空白輔料適量(約相當于左亞葉酸50 mg)，置于50 mL容量瓶中，精密量取10-甲酰葉酸對照品溶液儲備液1 mL加入，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續濾液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果表明左亞葉酸主峰與10-甲酰葉酸峰分離度大于2.5。

2.3.2 破壞試驗

采用強光照射、高溫、酸(堿)水解及氧化的方法對空白輔料及制劑進行加速破壞，用以考察可能存在的降解產物和降解途徑。

分別精密稱取左亞葉酸鈉凍干粉及空白輔料適量(約相當于左亞葉酸50 mg)，置于50 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液。取續濾液作為供試品溶液，分別精密量取各續濾液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以此作為破壞實驗的陰性對照樣品，考察各破壞實驗的結果。

(1)光破壞試驗

精密稱取左亞葉酸鈉凍干粉及空白輔料適量(約相當于左亞葉酸50 mg)，置于50 mL容量瓶中，加入流動相適量，超聲使溶解，在光照條件下(4500 lx)照射12 h以上，將各溶液稀釋至刻度，制成濃度約為1 mg/mL(以左亞葉酸計)的樣品溶液，濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明：與陰性對照樣品進行比較，光照對空白輔料及制劑均沒有破壞作用。

(2)酸破壞試驗

精密稱取左亞葉酸鈉凍干粉及空白輔料適量(約相當于左亞葉酸50 mg)，置于50 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度，超聲使溶解。水浴加熱2 h，放冷，濾過，棄去初濾液。精密量取續濾液以流動相稀釋制成濃度約為1 mg/mL(以左亞葉酸計)的樣品溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明：與陰性對照樣品進行比較，酸性環境制劑有較強破壞作用，產生了更多的雜質。

(3)堿破壞試驗

精密稱取左亞葉酸鈉凍干粉及空白輔料適量(約相當于左亞葉酸50 mg)，置于50 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液至刻度，超聲使溶解。水浴加熱2 h，放冷，濾過，棄去初濾液。精密量取續濾液以流動相稀釋制成濃度約為 1 mg/mL(以左亞葉酸計)的樣品溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明：與陰性對照樣品進行比較，堿性環境對制劑均有破壞作用，產生了更多的雜質。

(4)熱破壞試驗

精密稱取左亞葉酸鈉凍干粉及空白輔料適量(約相當于左亞葉酸50 mg)，置于50 mL容量瓶中，加入流動相至刻度，超聲使溶解。水浴加熱2 h，放冷，濾過，棄去初濾液。精密量取續濾液以流動相稀釋制成濃度約為1 mg/mL(以左亞葉酸計)的樣品溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明：與陰性對照樣品進行比較，熱環境對制劑有一定的破壞作用，產生了更多的雜質。

(5)氧化破壞

精密稱取左亞葉酸鈉凍干粉及空白輔料適量(約相當于左亞葉酸50 mg)，置于50 mL容量瓶中，加入雙氧水(30%過氧化氫)至刻度，超聲使溶解。水浴加熱2 h，放冷，濾過，棄去初濾液。精密量取續濾液以流動相稀釋制成濃度約為1 mg/mL(以左亞葉酸計)的樣品溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明：與陰性對照樣品進行比較，氧化環境對制劑有很強的破壞作用，產生了更多的雜質。

上述試驗結果表明：本品在強光下較穩定，未見明顯破壞，在酸破壞、堿破壞、熱破壞、氧化破壞條件下均不穩定；但在本色譜條件下各降解雜質峰均能與產品主峰有較好的分離度；表明該色譜條件下可能存在的已知雜質及強降解產生的未知雜質均能被有效檢出。證明該方法專屬性良好，滿足本品有關物質測定需求。

2.4 線性試驗

2.4.1 供試品線性試驗

精密稱取左亞葉酸鈉凍干粉適量(約相當于左亞葉酸 125 mg)，置于25 mL容量瓶中，加流動相適量，超聲使溶解，稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液。取續濾液作為線性試驗貯備液。分別精密量取線性試驗貯備液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，置6個25 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度制成0.20～1.20 mg/mL的系列溶液。分別精密量取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果見表1所示。

表1 供試品線性試驗

圖1 總峰面積線性圖

圖2 總雜質峰面積線性圖

結論：以上數據及圖譜表明，供試品溶液濃度在0.20～1.20 mg/mL范圍內，總雜質峰面積線性關系良好。

2.4.2 自身對照線性試驗

分別精密稱取左亞葉酸鈉凍干粉適量(約相當于左亞葉酸50 mg)，置于50 mL容量瓶中，加流動相適量，超聲使溶解，稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液。精密量取續濾液1 mL置于50 mL容量瓶中，加流動相并稀釋至刻度，制成濃度為 20 μg/mL的溶液，作為1%自身對照溶液線性試驗貯備液。分別精密量取線性試驗貯備液2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果見表2所示。

表2 1%自身對照溶液線性試驗

圖3 1%自身對照面積線性圖

結論：以上數據及圖譜表明，1%自身對照溶液濃度在4.0～14.0 μg/mL范圍內，主峰面積線性關系良好。

2.5 樣品檢出限

以1%自身對照溶液線性試驗1#溶液為檢出限起點樣品，分別以流動相稀釋10倍、20倍、40倍、80倍，分別精密量取上述溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，由檢出限圖譜可知，稀釋80倍時，當自身對照溶液濃度為0.0125 μg/mL時，主峰的峰高約為基線噪聲比的三倍，即為供試品溶液雜質的最低檢出限。

2.6 重復性試驗

精密稱取左亞葉酸鈉凍干粉適量(約相當于左亞葉酸 50 mg)，置于50 mL容量瓶中，加入流動相適量，超聲使溶解，稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液。取續濾液作為供試品溶液，同法制備6份。分別精密量取上述溶液適量，加流動相稀釋制成1 %自身對照溶液。精密量取上述各溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見表3、表4所示。

表3 供試品溶液重復性試驗結果

表4 1%自身對照溶液重復性試驗結果

結論：根據中國藥典及中國藥品檢驗標準操作規范的相關規定，以上數據表明，供試品溶液及1%自身對照溶液重復性良好。

2.7 溶液穩定性試驗

精密稱取左亞葉酸鈉凍干粉適量(約相當于左亞葉酸 5 mg)，置于25 mL容量瓶中，加入流動相適量，超聲使溶解，稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液。取續濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL置于100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為自身對照溶液。將上述溶液分別在室溫下放置4 h、6 h、8 h、10 h后，精密量取上述各溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見表5、表6所示。

表5 供試品溶液穩定性試驗結果

表6 1%自身對照溶液穩定性試驗結果

結論：以上數據表明，供試品溶液及1 %自身對照溶液在室溫0～10 h內穩定性良好，總雜質在10 h內雖然略有增加趨勢，但0、4、6、8、10 h總雜質RSD仍小于2.0，在偏差可接受范圍內，在我們暫定標準中可認為溶液穩定不小于8 h。

2.8 系統適用性試驗

色譜柱理論板數：按2.1制供試品溶液，精密量取續濾液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的3倍以上。

按2.1制備對照溶液(1)和對照液(2)。分別精密量取此液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。連續進樣，計算相對標準偏差，結果見表7所示。

表7 系統適用性試驗結果

結論：液相色譜圖及以上數據顯示，左亞葉酸峰理論板數 n=11231，主峰與最近雜質峰的分離度為1.76>1.5，對照溶液重復進樣相對標準偏差分別為0.29%和0.24%，均小于2.0%。結果表明，色譜條件良好，分離度良好。

2.9 有關物質檢查方法及結果

按2.1項制備3批供試品溶液及對照溶液(1)和對照液(2)，按2.2確定色譜條件進行測試。三批樣品有關物質檢查，結果見表8所示。

表8 三批產品測定結果

3 結 論

本試驗對高效液相色譜法法測定注射用左亞葉酸鈉有關物質的測定方法進行了研究，結果表明本試驗方法對產品中的雜質均能與主成分峰良好分離，強降解后產生更多雜質也能準確。溶液穩定性試驗結果表明樣品溶液總雜質在10 h內雖然略有增加趨勢，但0、4、6、8、10 h總雜質RSD仍小于2.0，在偏差可接受范圍內，暫定溶液穩定時間為8 h。三批樣品測定結果本方法用于注射用左亞葉酸鈉的有關物質重復性好，結果準確可靠，可用于注射用左亞葉酸鈉的有關物質檢驗。