蒼術-玄參藥對HPLC指紋圖譜的建立及指標性成分研究*

劉利利，劉穎新，彭攸靈，毛群芳，邱艷明，彭麗英

(湖南中醫藥高等專科學校，湖南 株洲 412012)

蒼術-玄參藥對配伍出自《施今墨對藥》，二者相須為用，臨床常用于糖尿病的治療[1]。在前期工作中，課題組對該藥對的進行了配伍比例、提取工藝以及有效部位等方面相關研究[2-4]，但目前對于該藥對的物質基礎研究相對不足。指紋圖譜技術可以反映復雜中藥體系中化學成分的種類與數量，具有客觀、全面的優點[5-6]。本研究從 HPLC指紋圖譜及多指標成分定量分析的角度，探討了蒼術-玄參藥對配伍的物質基礎，為蒼術、玄參配伍規律揭示，以及制劑開發等提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，安捷倫科技有限公司；AE240型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試 藥

乙腈為色譜純，美國TEDIA公司；水為怡寶純凈水；其他試劑均為分析純。對照品毛蕊花糖苷(批號：PS000442)、安格洛苷C(批號：PS000098)、哈巴俄苷(批號：PS000404)、肉桂酸(批號：PS000800)、白術內酯Ⅰ(批號：PS010510)、白術內酯Ⅱ(批號：PS010511)、β-桉葉醇(批號：PS010584)、蒼術素(批號：PS010182)，以上對照品純度均>98%，均購自成都普思生物科技股份有限公司。不同產地及批號蒼術、玄參樣品均經湖南中醫藥高等專科學校彭學著教授鑒定為：菊科植物茅蒼術Atractylodeslancea(Thunb.) DC.或北蒼術Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖；玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根，藥材及配伍信息見表1。

表1 藥材及配伍信息

2 方法與結果

2.1 對照品溶液

精密稱取毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇和蒼術素的對照品適量，加甲醇配制成質量濃度分別為4.780、5.216、4.305、5.681、5.510、4.742、3.751和4.523 mg·mL-1的單一對照品溶液；精密吸取上述對照品溶液各1 mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成質量濃度為毛蕊花糖苷478.0 μg·mL-1、安格洛苷C 521.6 μg·mL-1、哈巴俄苷430.5 μg·mL-1、肉桂酸568.1 μg·mL-1、白術內酯Ⅰ 551.0 μg·mL-1、白術內酯Ⅱ 474.2 μg·mL-1、β-桉葉醇375.1 μg·mL-1、蒼術素452.3 μg·mL-1的混合對照品溶液Ⅰ，精密吸取適量，依次用甲醇稀釋 2、5、10、25、50倍，分別作為溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。

2.2 供試品溶液

精密稱取蒼術粉末(過60目篩)2.0 g，置于具塞錐形瓶，加無水乙醇20 mL，超聲提取1.5 h，乙醇補足損失，5000 r·min-1離心15min，取上清液，過微孔濾膜，即得蒼術供試品溶液。精密稱取玄參粉末(過60目篩)1.0 g，置于具塞錐形瓶，加無水乙醇10 mL，超聲提取1.5 h，乙醇補足損失，5000 r·min-1離心15 min，取上清液，過微孔濾膜，即得玄參供試品溶液。取蒼術藥粉2.0 g和玄參藥粉1.0 g(二者均過60目篩)，置于具塞錐形瓶中，加無水乙醇20 mL，超聲提取1.5 h，乙醇補足損失，5000 r·min-1離心15 min，取上清液，過微孔濾膜，即得蒼術-玄參藥對供試品溶液。

2.3 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，5%→10%A；10～12 min，10%→20%A；12～28 min，20%→50%A；28～45 min，50%→63%A；45～55 min，63%→65%A；55～65 min，65%→80%A；65～75 min，80%→5%A)。在205 nm波長下檢測白術內酯Ⅱ和β-桉葉醇；280 nm波長下檢測毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白術內酯Ⅰ和蒼術素。流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量15 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液(C1-X1)，按“2.3”項下色譜條件連續進樣 6 次，以白術內酯Ⅰ色譜峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD均<2.0%，相對峰面積的RSD均<2.6%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液(C1-X1)，按“2.3”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h，進樣測定，以白術內酯Ⅰ色譜峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD均<1.2%，相對峰面積的RSD均<2.3%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗

取同一藥對蒼術、玄參藥材，按“2.2”項下方法平行制備 6份藥對供試品溶液，并按“2.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以白術內酯Ⅰ色譜峰為參照峰，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD均<1.5%，各共有峰相對峰面積的RSD均<1.8%，表明方法重復性良好。

2.5 蒼術-玄參藥對配伍前后指紋圖譜研究

2.5.1 指紋圖譜建立及相似度評價

取藥對供試品溶液按“2.3”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。將所得的色譜圖數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2012 版)》，得蒼術-玄參藥對HPLC指紋圖譜，見圖1。以16號峰白術內酯Ⅰ色譜峰為參照峰，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD<2.00%，表明色譜峰出峰穩定。不同樣品各共有峰的相對峰面積相差較大，表明不同配伍藥對的成分含量存在差異，結果見表2。對10批樣品進行相似度評價，結果表明樣品相似度均>0.90，說明各批次樣品相似度良好，方法穩定，結果見表3。

圖1 10批蒼術-玄參藥對HPLC疊加圖譜

表2 蒼術-玄參藥對樣品共有峰的相對峰面積

續表2

表3 藥對指紋圖譜相似度評價結果

2.5.2 色譜峰的歸屬

由圖2可以看出，1～5號峰來源于玄參，6～18號峰來源于蒼術，通過混合對照品色譜圖對樣品指紋圖譜各峰進行定性分析，結果表明編號 1、3、4、5、10、16、17、18號峰分別為毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅰ、β-桉葉醇和蒼術素。

圖2 混合對照品(A)、蒼術C1(B)、玄參X1(C)及蒼術-玄參藥對C1-X1(D)的HPLC圖譜

2.5.3 聚類分析

將10批蒼術-玄參藥對指紋圖譜的18個共有峰的相對峰面積數據導入SPSS 22.0軟件，采用Ward法聚類，以平方Euclidean距離為量度，進行聚類分析，結果見圖3。當類間距為5時，樣品可聚為 3類，S2、S6、S10號樣品為一類，S1、S3 ～ S5、S8～S9號樣品為一類，S7號樣品單獨聚為一類。

圖3 10批蒼術-玄參藥對聚類分析圖

3 蒼術、玄參配伍前后指標性成分含量變化研究

3.1 線性關系考察

精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液Ⅰ～Ⅵ適量，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，以對照品的質量為橫坐標(X)，色譜峰面積為縱坐標(Y)，進行回歸，結果見表3。由結果可知，各成分在各自范圍內線性關系良好。

表3 各成分線性關系

3.2 精密度試驗

取“2.1”項下混合對照品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定6次，測得毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇和蒼術素峰面積RSD分別為1.13%、0.96%、1.07%、0.94%、0.98%、1.25%、1.22%、1.06%，表明儀器精密度良好。

3.3 重復性試驗

將藥對C1-X1樣品，按“2.2”項的制備方法平行制備 6 份，在“2.3”項的色譜條件連續進樣，記錄毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇和蒼術素峰面積，計算藥對C1-X1樣品8種待測成分重復性的RSD，分別為 0.95%，0.83%，0.72%，1.09%、1.23%、1.12% 、1.08%和0.86%，表明本試驗方法的重復性良好。

3.4 穩定性試驗

取同一份供試品溶液(C1-X1)，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.3”項色譜條件下進樣測定，測得毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇和蒼術素峰面積RSD分別為0.88%、1.28%、0.89%、0.92%、1.30%、1.26%、0.90%、1.17%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

3.5 加樣回收率試驗

取“3.4”項下已測知8種成分準確含量的C1-X1供試品9 份，再分別精密加入相當于含量120%、100%、80%的毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇和蒼術素對照品溶液，分別制備得到高、中、低不同濃度的供試溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算平均加樣回收率分別為98.28%、99.21%、101.30%、95.72%、96.59%、100.16、97.02%和99.78，RSD分別為0.81%、0.97%、1.16%、1.28%、1.21%、0.92%、0.90%和1.32%。

3.6 樣品含量測定

按“2.2”項下方法制備蒼術(C1～C10)、玄參(X1-X10)以及藥對(C1～X1)～(C10～X10)供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定各樣品中毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇和蒼術素等 8種成分的含量。結果見表4。

表4 各成分含量測定結果(n=3)

4 討 論

4.1 色譜條件的選擇

實驗過程中考察了不同的流動相的組成，結果發現，乙腈-磷酸水對峰形改善有較大的幫助作用，而且避免了個別色譜峰的拖尾問題，且磷酸的濃度對峰形影響不大。流動相的流速對出峰時間和分離效果影響較大，當流速大于0.8 mL/min時，部分色譜峰分離度較低。此外，柱溫低于30 ℃時，部分色譜峰峰形不對稱。

4.2 結果分析

通過 HPLC 法建立了蒼術-玄參藥對的指紋圖譜，10 批樣品的相似度均>0.90，符合指紋圖譜研究要求，為該藥對質量控制整體提升提供了依據。由蒼術、玄參單味藥材及藥對化學成分含量分析可知，該藥對配伍后毛蕊花糖苷、安格洛苷C、白術內酯Ⅱ、β-桉葉醇、蒼術素含量有一定程度增高，而哈巴俄苷、肉桂酸、白術內酯Ⅰ含量有所降低。這些指標性成分的含量變化為該藥對進一步的藥理機制研究和臨床應用提供了參考。

5 結 論

通過本研究建立的蒼術-玄參藥對指紋圖譜及含量測定方法穩定可靠，能快速、準確地對藥對進行質量評價，同時為含有該藥對的制劑質量控制提供了參考。