HPLC測定豆制品中丙酸鈣結(jié)果的不確定度評價(jià)*

劉強(qiáng)欣，林 婷，聞佳鈺，王志超，鐘寒輝，董葉箐

(綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310522)

豆制品營養(yǎng)豐富，豆能夠降低人體血液中的膽固醇，有預(yù)防消化系統(tǒng)癌癥及其他疾病的功效。因此被廣大消費(fèi)者譽(yù)為21世紀(jì)最喜愛的食品之一[1]。然而豆制品保存卻相對較難容易變質(zhì)腐敗，為了延長豆制品的保質(zhì)期，人們會(huì)添加一些食品防腐劑。丙酸(propanoic acid)及其鹽類是世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO) 批準(zhǔn)使用的安全可靠的食品防霉劑[2]，具有抑制微生物增殖和殺滅微生物的作用，是天然防腐劑的重要組成部分，能參加人體正常新陳代謝，對于人體無害[3]，常以丙酸鈣或丙酸鈉的形式存在，用于食品防腐和防霉[4]。有關(guān)研究表明人體長期過量攝入含丙酸及其鹽類的食品會(huì)導(dǎo)致嘔吐、腹痛和肺水腫等[5-6]，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[7]規(guī)定豆類制品限量為2.5 g/kg(以丙酸計(jì))。

測量不確定度是對測量結(jié)果質(zhì)量的定量表征，很大程度上決定了測量結(jié)果的可靠性[8-10]，為了保證豆制品中丙酸鈣含量檢測結(jié)果科學(xué)性，依據(jù)測定不確定度準(zhǔn)則[11-13]參照標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.120-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙酸鈉、丙酸鈣的測定》[14]，建立數(shù)學(xué)模型，對結(jié)果進(jìn)行不確定度評估，為結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)采用的試劑為：甲醇(色譜純)，F(xiàn)isher；磷酸氫二胺(分析純)，浙江長青化工；磷酸(分析純)，浙江長青化工；丙酸鈣(純度98.0%)，Dr.Ehrenstorfer；其余試劑均為市售分析或以上規(guī)格，浙江長青化工；超純水儀制備；混合微孔濾膜(0.22 μm)；豆制品，超市購買。

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)采用的儀器為：島津LC-2030C高效液相色譜儀器(配有二極管陣列檢測器)，日本島津公司；BSA224S型電子天平，德國賽多利斯；Kjeltec 8400凱式定氮儀，foss；pHS-3C酸度計(jì)，雷磁；色譜柱(Agela Innoval ODS-2 ；250 mm× 4.6 mm，5.0 μm)；超純水系統(tǒng)，美國Millipore超純水儀制備。

1.3 液相色譜參考條件

(1)色譜柱：Agela Innoval ODS-2(250 mm×4.6 mm， 5.0 μm)；

(2)流動(dòng)相：甲醇+1.54 g/L磷酸氫二胺=5+95；

(3)檢測波長：214 nm；

(4)柱溫：40 ℃；

(5)流速：1.0 mL/min；

(60進(jìn)樣體積：20 μL。

1.4 試樣處理

準(zhǔn)確稱取25 g置于250 mL燒杯中，轉(zhuǎn)移置于500 mL蒸餾瓶中加入100 mL水，再用50 mL水沖分多次沖洗燒杯，洗滌液合并至蒸餾瓶中，加入20 mL磷酸溶液(1 mol/L)，通過水蒸氣蒸餾，將250 mL容量瓶作為吸收液裝置，待蒸餾至約 240 mL時(shí)取出，在室溫下放置30 min，用1 mol/L磷酸溶液調(diào)pH為3左右，加水定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后，進(jìn)液相色譜測定。

2 模型建立

根據(jù)樣品測試方法的過程，建立豆制品中丙酸鈣(以丙酸計(jì))殘留量不確定度評估數(shù)學(xué)模型為：

注：X為試樣中丙酸含量，g/kg；ρ為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的試樣液中待測物的質(zhì)量濃度，mg/L；V為樣液最終定容的體積，mL；m為試樣的稱樣量，g；1000為由mg/kg轉(zhuǎn)換為g/kg的換算因子。

3 結(jié)果與分析

3.1 不確定度的引入：標(biāo)準(zhǔn)溶液

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制過程：精確稱取0.234201 g丙酸鈣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度為98.0%)，加水溶解并定容至25 mL，折算為丙酸后標(biāo)樣濃度為7304.2 mg/L。

標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制過程：分別吸取丙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.171 mL、0.342 mL、0.856 mL、1.711 mL、3.423 mL 于500 mL蒸餾瓶，按照試樣處理進(jìn)行蒸餾，最終用水定容置250 mL容量瓶，配制成濃度為0.005 g/L、0.01 g/L、0.025 g/L、0.05 g/L、 0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

3.1.1 不確定度u(p)的引入：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度

丙酸鈣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書上的相對不確定度urel(p)=2.0%

3.1.2 不確定度u(m)的引入：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量

丙酸鈣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱取量為0.234201 g，通過配恒體方法兩次的測量值相減得出，則由稱量產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度應(yīng)為：

3.1.3 不確定度u(V)的引入：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制

(1)不確定度的引入：配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液所有容器

將稱取的丙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解并定容至25 mL的容量瓶中，根據(jù)JJG 196-2006[15]《中華人民共和國國家計(jì)量檢定規(guī)程》，在(25±1)℃時(shí)25 mL單標(biāo)線容量瓶(A級)容量允許為 ±0.03 mL，其不確定度為矩形分布(B類評定)，則容量瓶的不確定度為：

(2)不確定度的引入：配制標(biāo)準(zhǔn)工作液所有容器

①引入的不確定度來源：移液管

移液管準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于500 mL 蒸餾瓶中，經(jīng)蒸餾配制成相應(yīng)濃度的工作液，根據(jù)JJG 196-2006[15]， 移液管(A級)對于的允許誤差如表1所示。

表1 工作液濃度、移取體積及對于移液管最大允許誤差

則移液管的不確定度為：

②不確定度的引入：容量瓶

丙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液最終定容至250 mL 容量瓶，依據(jù)JJG 196-2006[15]，(25±1)℃時(shí)250 mL 單標(biāo)線容量瓶(A級)允許容量為±0.15 mL，則不確定度為矩形分布(B類評定)，容量瓶的不確定度是：

因此容器引入的相對不確定度為：

=1.54%

3.1.4 不確定度u(g)的引入：標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合

上機(jī)測定丙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上5個(gè)不同工作液濃度，對應(yīng)的峰面積與濃度如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度與對應(yīng)峰面積

采用最小二乘法，以丙酸的濃度X與其對應(yīng)的平均峰面積Y進(jìn)行線性擬合，得丙酸的標(biāo)曲線：Y=339743X-35.992，線性相關(guān)系數(shù)為0.999。

對測試樣進(jìn)行6次測量，得峰面積A，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得提取液中丙酸的濃度分別為0.258 g/kg、0.252 g/kg、0.249 g/kg、0.255 g/kg、0.249 g/kg、0.261 g/kg，平均值為0.254 g/kg，最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得樣品中丙酸含量過程所引入的相對不確定度為：

其中：

則最小二乘法擬合過程產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2 液相色譜儀測定引入的不確定度

3.3 樣品引入的不確定度

3.3.1 樣品稱量引入的不確定度u(M)

3.3.2 樣品定容引入的不確定度u(a)

試樣最終定容至250 mL 的容量瓶，依據(jù)JJG 196-2006[15]，(25±1) ℃時(shí)250 mL 單標(biāo)線容量瓶(A級)允許容量為 ±0.15 mL，則不確定度為矩形分布(B類評定)，容量瓶的不確定度是：

3.4 不確定度的引入：樣品測量重復(fù)性

對待測樣品進(jìn)行六次重復(fù)性測定，所得結(jié)果見表3所示。

表3 樣品六次平行所測結(jié)果

得出測量重復(fù)性引入的相對不確定為：

3.5 標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

不確定度分量不確定度來源不確定度值/%u rel(M)樣品稱量0.00116u rel(a)樣品體積0.0346u rel (p)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度2.00u rel(m)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量0.174u rel(v)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1.54%u rel(g)標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線0.250u rel(e)樣品重復(fù)測量1.93u rel(y)儀器系統(tǒng)0.924

3.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算

=3.32%

3.7 擴(kuò)展不確定度

在95%的置信區(qū)間下，取包含因子k=2，其相對擴(kuò)展不確定度為：

Urel(X)=k×urel(X)=2×3.32%=6.64%

豆類制品中丙酸鈣(以丙酸計(jì))的含量為0.254 g/kg，得擴(kuò)展不確定度為

U=0.254 g/kg×6.64%=0.0169 g/kg

綜上可得豆類制品中丙酸鈣(以丙酸計(jì))含量的不確定度報(bào)告為：(0.254±0.0169)g/kg(k=2)。

4 結(jié) 論

通過對豆制品中丙酸鈣含量的不確定度評定，得出樣品中丙酸鈣(以丙酸計(jì))的含量為 (0.254±0.0169) g /kg，k=2，置信概率 P=95%。本文全面地分析了HPLC法測定丙酸含量實(shí)驗(yàn)過程不確定度的來源，并計(jì)算了各不確定度分量。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度和樣品重復(fù)性測定是合成不確定度的主要來源。因此日常檢測中所使用的儀器、配制溶液的步驟，環(huán)境、試劑等客觀影響因子都必須達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求，不斷提高操作人員的熟練程度以提升檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。