安朵仙水母(Cassiopeia andromeda)水母體再生研究

李 達, 王 瑋, 齊繼光

安朵仙水母(Cassiopeia andromeda)水母體再生研究

李 達, 王 瑋, 齊繼光

(青島海洋科技館, 山東 青島 266003)

本實驗對安朵仙水母()進行不同程度(傘體、胃囊、口腕和觸手)的切割, 進行60 d再生過程觀察。首次記錄了安朵仙水母水母體的再生情況: 切除部分傘體、全部胃囊、全部口腕和觸手的水母體殘體能夠再生出缺失的部分; 切除全部傘體的水母體殘體無法再生出新的傘體, 而是反向再生出新的口腕和觸手; 同時切除不同部位的水母體殘體在組織修復時表現出一定的再生順序性。結果表明安朵仙水母水母體具有較強的組織再生能力, 可作為缽水母綱再生研究的潛在模式物種, 同時為刺胞動物研究以及再生生物學研究提供一定借鑒。

安朵仙水母; 水母體; 缽水母綱; 再生; 存活

安朵仙水母()屬刺胞動物門(Cnidaria)、缽水母綱(Scyphozoa)、根口水母目(Rhizostomae)、仙水母科(Cassiopeidae)、仙水母屬()。作為海洋館水母展示中的常見種類, 安朵仙水母色彩艷麗, 泳姿獨特, 其傘體和口腕中有大量蟲黃藻與之共生, 具有較高的觀賞性和研究價值。

再生是后生動物的共同特征, 從海綿一直到脊索動物[1-2]。刺胞動物具有較強的再生能力, 其大多數物種能夠再生出身體的大片區域或部位, 有些物種僅用幾百個細胞便能夠實現完全再生[3]。水螅的再生研究較為廣泛, 其少量的組織甚至分離的細胞即可再生出完整的個體[4]。在水母研究中, 細胞分化程度較高的階段, 如碟狀幼體, 同樣被觀察到原有身體結構的重組和再生[5-8], 而水母體再生的相關報道主要集中在其修復失去的結構[3, 9-11]。盡管水母體的形態與水螅體相比相對復雜, 但一些種類水母仍然可以再生出各種器官, 甚至由碎片重組整個身體[12-18], 表現出強大的修復和再生能力[19-21], 如水母的組織中擁有大量活躍的增殖細胞, 且在空間分布上表現出一定差異性[14],水母在碎片化處理后首先快速恢復呈典型的鐘形, 隨后緩慢地進行缺失器官的再生[15]。

刺胞動物中典型的水螅, 比如水螅屬、介螅水母屬和海葵屬已經成為理解動物再生的模式生物。而水母被認為是獨特的模式生物, 用以研究復雜器官再生和全身再生的共同原理和多樣機制[22]。本實驗對不同程度切割下的安朵仙水母水母體再生過程進行了詳細記錄, 旨在為刺胞動物研究以及再生生物學研究提供一定借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

安朵仙水母碟狀體及水母體均為本實驗室自行培育。碟狀體經過約1個月培養后, 挑選形態完整, 傘體收縮活力正常, 傘體半徑2.0±0.5 cm的水母體作為實驗對象。碟狀體和實驗期水母體投喂餌料均為活體鹵蟲()無節幼體。

1.2 方法

設1個對照組, 7個實驗組, 每組3個平行, 每個平行10只水母。所用實驗缸為200 L亞克力環形水母缸, 進缸24 h內不進行任何投喂。水母放入后, 對水流進行調節, 使每只水母自然吸附于缸體側壁。實驗組分別對水母傘體、胃囊或口腕進行不同程度切割, 切割方法為平鋪于光滑玻璃板上, 用滅菌刀片進行直線切割, 切割位置如圖1所示。具體切割細節如下: 組a, 對照組, 不做任何處理; 組b, 切割位置為傘緣至外傘凹陷圈中間位置; 組c, 切割位置為外傘凹陷圈至胃囊外緣中間位置; 組d, 胃囊外緣至傘體中心中間位置; 組e, 對半切割, 保留1/2; 組f, 連續對半切割, 保留1/4; 組g, 傘緣至外傘凹陷圈中間位置, 且切除全部胃囊及口腕; 組h, 切除傘體, 只保留胃囊、口腕和觸手。所有組在切割傘體同時, 切除垂直面對應口腕及觸手。

圖1 水母切割及測量示意圖

注: 圖中a～i分別為組a～組h及測量視圖, 組a為對照組,0、1和2分別為切割線半徑、再生傘體半徑和正常傘體半徑

每5 d在投喂前從各缸隨機取3只水母, 測量和記錄切割線半徑(圖1中0)、再生傘體半徑(即再生傘體的傘緣中心點處傘體半徑, 圖1中1)及正常傘體半徑(圖1中2), 觀察記錄胃囊愈合和口腕、觸手再生情況, 記錄存活數。將水母放入實驗托盤, 使其傘體自然鋪平, 用游標卡尺(美耐特)測量傘體半徑。用顯微鏡(奧林巴斯SZX2-ILLD)觀察水母局部組織再生情況。投喂時間為每日上午10: 00, 投喂頻率為每日1次。餌料投喂量滿足當前水母個體所需, 且有多余殘餌出現。

所用實驗源水為沿海礁巖區天然海水, 經沉淀、石英砂缸過濾和紫外燈殺菌處理。各組水溫維持23±1 ℃, 鹽度維持32±1。選用光源為90 W太空燈(希帝萊), 每日光照12 h, 昏暗12 h, 光強變化模擬日出日落。每缸配有紫外殺菌燈, 加熱裝置和制冷系統。每日傍晚進行吸污處理, 清除剩余餌料和排泄物。每日使用滴流桶對所有缸進行淡水補充。每2 d對所有缸進行鹽度、亞硝態氮(NO2–-N)、總氨氮(TAN)、pH檢測, 通過換水及時調整水質到理想指標(鹽度32±1, 亞硝態氮<0.02 mg/L, 總氨氮<0.05 mg/L, pH維持7.8～ 8.1)。每5 d更換部分海水, 換水量為總水量的10%, 實驗為期60 d。

1.3 數據處理

傘體半徑、胃囊愈合率、口腕、觸手再生出現率以及存活率用平均值±標準差表示。

胃囊愈合率、口腕、觸手再生出現率和存活率按下式計算:

胃囊愈合率/% =1/×100%,

口腕、觸手再生出現率/% =1/×100%,

存活率/% =1/×100%,

式中,1為單次取樣中胃囊完全愈合的水母數量,為單次取樣水母數量;1為單次取樣中口腕和觸手再生的水母數量,為單次取樣水母數量;1為存活的水母數量,為初始水母數量。

利用Excel 2010和SPSS 20.0統計分析軟件對各項數據進行整理和分析, 用Origin 2018軟件進行繪圖。用單因子方差分析法分析組間差異, 用Student – Newman – Keul’s檢驗法分析組間顯著性,<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 不同程度切割下安朵仙水母再生情況

各處理組水母傘體恢復結果見表1所示。第60 d正常傘體半徑結果顯示: 對照組、組b和組c均相對較大, 相互間差異不顯著, 與其他組差異顯著; 組d和組e次之, 分別與其他組差異顯著; 組f和組g均相對較小, 相互間差異不顯著, 分別與其他組差異顯著。第60 d再生傘體半徑結果顯示: 組c最大, 與其他組差異顯著; 組d、組b和組e次之, 其中組d和組b相互間差異不顯著, 與其他組差異顯著, 組e與其他組差異顯著; 組g、組f和組h均相對較小, 分別與其他組差異顯著。對比發現: 組b、組c、組d和組e的再生傘體半徑均大于正常傘體半徑; 組f的再生傘體半徑小于正常傘體半徑; 組g的再生傘體半徑與正常傘體半徑大小相同。

表1 不同程度切割下安朵仙水母傘體再生情況

注: 同一列中上標不同字母表示差異顯著(<0.05), 上標相同字母表示差異不顯著(>0.05), N表示無數據。

不同時間段各處理組水母再生情況曲線圖如圖2所示。結果顯示: 組a傘體隨時間逐漸增大; 組b切割線第10 d消失, 再生傘體第10 d基本恢復正常, 且隨后始終略微大于正常傘體; 組c和組d切割線均在第35 d消失, 再生傘體第20 d基本恢復正常, 且隨后始終明顯大于正常傘體, 其中組d水母正常傘體在初期呈現出輕微停滯隨后增大; 組e切割線第35 d消失, 再生傘體第30 d基本恢復正常, 且隨后略小于正常傘體, 在末期顯現出大于正常傘體趨勢; 組f切割線始終存在, 再生傘體從第15 d開始出現, 隨后逐漸增大但未大于正常傘體, 正常傘體呈先縮小后逐漸緩慢恢復到切割前大小; 組g切割線第20 d消失, 正常傘體先縮小至與再生傘體大小相同, 后第40 d開始兩者同步逐漸增大; 組h始終無再生傘體出現。

圖2 不同程度切割下安朵仙水母再生情況曲線圖

不同時間段各處理組水母的胃囊愈合率見表2所示。結果顯示: 組d在第5 d出現胃囊愈合, 且愈合率為100%; 組e在第5 d出現胃囊愈合, 在第15 d胃囊愈合率達到100%; 組f在第10 d出現胃囊愈合, 在第15 d胃囊愈合率達到100%; 組g在第15 d出現胃囊愈合, 在第20 d胃囊愈合率達到100%; 組h在第10 d出現胃囊愈合, 且愈合率為100%。

表2 不同程度切割下安朵仙水母胃囊愈合率(%)(0～60 d)

注: N表示無數據。

不同時間段組g和組h安朵仙水母的口腕和觸手再生出現率見表3所示。結果顯示: 組g和組h均在第20 d開始出現再生口腕和觸手, 隨后均在第30 d全部出現再生口腕和觸手。

表3 組g和組h安朵仙水母口腕和觸手再生出現率(%)(0～60 d)

2.2 不同程度切割對安朵仙水母水母體存活率的影響

不同程度切割下安朵仙水母存活率見表4所示。除組f水母存活率為80%±10%以外, 其他組存活率均為100%, 組f的存活率對比其他組差異顯著(< 0.05)。

表4 不同程度切割下安朵仙水母存活率(60 d)

注: 同一行中上標不同字母表示差異顯著(<0.05), 上標相同字母表示差異不顯著(>0.05)。

3 討論

水母通過細胞動力學和協調不同的細胞/組織通信以再生相對復雜的器官和整個身體, 重建放射對稱被認為可能是器官和生物體功能再生的關鍵步驟, 而對于自由游動的水母體, 再生模式必須包括重新建立徑向對稱, 以產生游動的推進力[22]。本實驗所觀察的安朵仙水母水母體在傘體部分缺失的情況下, 均能再生出徑向對稱組織, 與上述結論一致。實驗觀察到, 組b～組d水母在恢復期早期, 傘體并非保持原形態進行缺失部分的再生, 而是在切割處出現一定程度的傘體凹陷(圖3a), 同時正常傘體部分仍然繼續緩慢生長(圖2), 可能由于正常部分的傘體體積大于被切除部分, 正常傘體細胞增殖數量大于再生部分, 物理作用導致凹陷產生。傷口愈合是伴隨著組織重建的最初的再生過程, 目的是在縮小損傷后的物理縫隙, 恢復組織的完整性[22]。實驗發現, 該水母體的傷口愈合表現為組織再生, 而非傷口閉合, 由中膠層直接再生出缺失的傘體組織。而切割后一段時間, 所有組切割線半徑值基本不變(圖2), 認為切割處部分組織細胞處于增殖停滯狀態。根據曲線圖和圖3可以看出, 組b～組e水母的傘體再生半徑均大于正常半徑, 表現為再生部分傘緣外凸(圖3b), 這一現象表明水母殘體在重建徑向對稱過程中, 再生組織的復制程度并未達到與原形完全一致,水母碎片在重建組織后同樣與原徑向對稱存在差異, 認為柄在重建整體的過程中起著關鍵作用[15]。

圖3 安朵仙水母的形態變化圖

經典的體外實驗表明, 從水母傘體中分離出的肌肉組織在特殊條件培養下可以重建出新生器官[23]。這種再生模式在水母中曾被報道, 各種大小和形狀的傘體碎片分別在12 h內恢復為最初的鐘形, 隨后每個碎片都不同程度地再生出其缺失的器官, 如口柄、觸手、輻管、性腺等, 最終恢復為具有功能性的有機體[15]。而含有橫紋肌細胞的水母傘體組織暴露在不同的培養條件下, 可以轉分化為新的細胞類型, 隨后再生出攝食和性腺結構[24]。通過使用EdU染色發現,水母的增殖細胞群在空間分布上表現出一定差異性, 傘體中分布均勻有助于整體體型的增大, 而觸手中分布為簇狀, 有助于分支結構的形成[14]。本實驗中, 安朵仙水母水母體在切除全部胃囊、口腕和觸手后, 仍然能夠再生出缺失的部分, 證實了安朵仙水母具有類似的再生能力, 但沒有與胃囊相連的傘體組織碎片, 能否在離體后單獨進行去分化和轉分化以重建未曾相連的組織, 目前尚不明確。本實驗中切除全部傘體的水母殘體(組h), 未像預期一樣重新再生出缺失的傘體, 而是在修復完畢的胃囊表面, 反向再生出新的口腕和觸手(圖4a), 并與再生的胃囊相通, 表明安朵仙水母可能不具備任意組織碎片再生出完整個體的能力。本研究中, 組g水母的胃囊全部愈合時間是第20 d(表2), 口腕和觸手在第30 d全部開始出現再生(表3, 圖4b), 受損傘體和正常傘體在第40 d開始出現生長(圖2g), 可能安朵仙水母在完全缺失胃囊、口腕、觸手和輕微缺失傘體后, 會優先將能量依次用以重建胃囊、口腕和觸手, 期間導致正常傘體萎縮, 再生傘體停滯, 在具備一定的攝食能力后, 再進行受損傘體的再生和正常傘體的生長, 表明了水母不同組織細胞的分化和分裂具有明顯的順序性。研究發現, 當安朵仙水母組織受損較輕時(受損傘體占整體的一半以內, 或胃囊輕微破損), 受損傘體和正常傘體均有生長趨勢, 且再生傘體的恢復速度明顯快于正常傘體生長速度(圖2b～圖2d)。當安朵仙水母組織受損嚴重時(受損傘體大于等于整體的一半且胃囊嚴重破損), 則優先恢復受損傘體到與正常傘體大小一致, 期間正常傘體生長緩慢甚至出現先萎縮后恢復情況(圖2e～圖2f), 可能與早期破損胃囊無法收集食物以吸收足夠營養有關。

圖4 安朵仙水母的胃囊、口腕和觸手再生情況

安朵仙水母在缺失組織后仍表現出較高存活率(表4), 甚至在切除全部傘體(組h)或全部口腕和胃囊(組g)后, 剩余部分仍能全部繼續存活, 表明其具有較強的受創后存活能力。其中組f部分水母在愈合過程中出現嚴重畸形導致無生命活力被淘汰, 出現差異性再生情況的原因尚不明確。

仙水母屬水母的水母體在傘體損傷后產生了新的特殊結構, 表明傘體組織有可能再生出身體的各個部位[2]。本實驗周期結束6個月后, 于暫養缸中發現一只安朵仙水母的復原傘體邊緣另長出一個具有胃囊、口腕和觸手的相連個體(圖5), 與上述研究者所記錄的結果相似。該特殊結構與母體相連, 顯示出獨立的放射狀輻管, 并與傘緣環管相連。本實驗處理組水母中僅此一例情況, 且為實驗結束較長時間后發現其形態改變并進行記錄。由于目前還沒有關于啟動或停止安朵仙水母增殖、分化或轉分化的細胞線索和分子誘導劑或抑制劑的相關研究[2], 無法證實其再生機制的統一性和差異性以及刺激和調動此種再生方式為何種因素, 因此還需開展更深入的實驗予以探究。

圖5 安朵仙水母的特殊再生結構

本研究觀察到的安朵仙水母水母體在不同程度損傷下的再生過程, 證實了安朵仙水母具有強大的傘體、胃囊、口腕和觸手再生能力, 為安朵仙水母再生時的組織生長和形態研究奠定了基礎, 同時也對其部分組織的再生差異性產生疑惑。隨著水母在生物學研究中得到越來越多的重視, 開展安朵仙水母組織動力學研究, 再生過程和機理的分子生物學研究, 以及人工調控基因表達, 將對其他刺胞動物門生物的進化和再生機制提供理論和實踐幫助。

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Regeneration in medusae of the upside-down jellyfish

LI Da, WANG Wei, QI Ji-guang

(Marine Science and Technology Museum, Qingdao 266003, China)

In this study, we cut medusae ofto different degrees (umbrella, stomach, oral arms, and tentacles) and observed them for 60 days. This study provides the first record of regeneration of medusae in, including medusae with part of the umbrella, all the stomach, all oral arms, and tentacles. Following excision, the missing tissue can regenerate: medusae with the entire umbrella excised regenerated new oral arms and tentacles on the repaired stomach instead of the umbrella, and there was a certain sequence of regeneration in the tissue repair of different parts excised at the same time. This study showed that medusae ofhave a high capacity for tissue regeneration and could be used as a potential model species of Scyphozoa for regeneration research and provide a valuable reference for research on Cnidarian and regenerative biology.

; medusae; Scyphozoa; regeneration; survival

Aug. 23, 2021

[Science and Technology Project of Shinan District, Qingdao, No. 2016-3-001-ZH]

Q959.132.4

A

1000-3096(2022)06-0109-07

10.11759/hykx20210823002

2021-08-23;

2021-10-12

青島市市南區科技計劃項目(2016-3-001-ZH)

李達(1989—), 男, 山西平遙人, 工程師, 碩士, 主要從事海洋生物研究, E-mail: seamanrickey@163.com; 齊繼光(1968—),通信作者, 男, 高級工程師, 館長, E-mail: qjg111@vip.sohu.com

(本文編輯: 趙衛紅)