參芍口服液對急性心肌梗死大鼠的心肌保護作用分析

劉 帆，邸亞麗，馬 威，李 霞，楊立明，亢小麗，郭 月，紀 征

急性心肌梗死(AMI)指急性發(fā)作的冠狀動脈缺血缺氧導致心肌壞死，臨床表現以胸骨后或心前區(qū)劇烈的壓榨性疼痛為主，服用硝酸甘油無法緩解，嚴重者可發(fā)展為心力衰竭，危及生命[1]。我國AMI發(fā)病率逐年上升，1987—2014年AMI相關死亡人數增加了5.6倍[2]。再灌注治療能及時挽救受損心肌，是AMI首選治療方式[3]，但治療時間窗極大限制了其臨床應用。既往西藥在逆轉心肌損傷方面的效果不理想，因此亟須尋找治療AMI的新藥。中醫(yī)藥用于AMI治療歷史悠久，參芍口服液主要成分包括丹參、黃芪、當歸、赤芍、川芎等，具有活血化瘀、調氣養(yǎng)血等功效，臨床已用于治療冠心病、心絞痛。薛忠文等[4]發(fā)現參芍口服液治療冠狀動脈粥樣硬化效果顯著；賈春新等[5]發(fā)現參芍口服液可抑制糖尿病大鼠肝臟氧化應激，對肝臟具有保護作用，但其是否對AMI造成的心肌損傷具有積極作用，尚無確切證據。Wnt/β-catenin信號通路是一種多元復雜的級聯放大信號通路，參與調控細胞增殖、分化、凋亡等多個病理生理過程。本研究通過制備AMI大鼠模型，從分子生物學角度，基于Wnt/β-catenin信號通路研究參芍口服液對AMI的作用機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 65只雄性SPF級SD大鼠，8周齡，體質量(250.3±25.1)g，購于解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所動物實驗中心，實驗動物許可證號：SCXK-(軍)2009-003。

1.2藥物與試劑 參芍口服液(唐山工人醫(yī)院制藥室，批準文號Z20050957)，貝那普利片(成都地奧制藥集團有限公司，國藥準字H20053390)。白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，Wnt10b、β-catenin兔抗鼠多克隆一抗工作液(美國Abcam公司)，DAB顯色液(福州萊博生物技術有限公司)，SP免疫組織化學染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1動物模型制備及藥物干預：隨機選取10只大鼠作為假手術組，其余建立AMI模型。將造模成功大鼠隨機分為模型組及低、中、高劑量參芍口服液組和陽性對照組。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按文獻[6]方法復制AMI大鼠模型，術前12 h禁食，10%水合氯醛麻醉后，固定于手術臺上，四肢插入心電圖電極，連接Powerlab數據采集分析系統(tǒng)。采用小動物呼吸機以10 ml潮氣量行人工通氣，95/min，常規(guī)備皮、消毒后于左側第三肋間開胸暴露心臟，在冠狀動脈左前降支距左心耳起始處2～3 mm處結扎，當結扎部位心肌組織由鮮紅色變成暗紅色甚至蒼白，心電圖示ST段弓背向上性抬高，視為造模成功，后逐層縫合傷口。假手術組開胸后不予結扎。手術均在無菌條件下進行。術后大鼠死亡5只，造模成功大鼠隨機分為5組，每組10只。術后1 d開始藥物干預，低、中、高劑量參芍口服液組分別給予3.2、6.4、12.8 ml/kg參芍口服液灌胃，陽性對照組予貝那普利10 mg/(kg·d)灌胃[7]，假手術組和模型組大鼠予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)4周。末次治療1 h后行超聲心動圖評估左心室功能；取腹主動脈血離心取血清用于生化指標和ELISA試劑盒檢測；處死后取梗死心肌組織，一部分固定于4%多聚甲醛中，其余部分保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2心功能評估：末次治療1 h后，所有大鼠予10%水合氯醛麻醉后固定，行超聲心動圖測量左心室射血分數(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)、左心室舒張末期內徑(LVIDd)、左心室收縮末期內徑(LVIDs)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)。采用全自動生化儀檢測大鼠血清肌酸激酶(CK)、心肌型肌酸激酶同工酶(CK-MB)、腦鈉肽(BNP)水平。

1.3.3心肌組織HE染色：大鼠梗死心肌組織于4%多聚甲醛中固定72 h后，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋制成蠟塊后切片，經梯度乙醇脫蠟至水后，行蘇木素染色、浸入鹽酸乙醇，再用自來水沖洗載玻片，至核變?yōu)樗{色，再依次放入95%乙醇2 min、伊紅1 min染色，經梯度乙醇脫水透明后封片，在光學顯微鏡下觀察心肌組織病理學變化。

1.3.4ELISA檢測炎性因子：采用ELISA試劑盒檢測大鼠外周血炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書要求操作。

1.3.5免疫組織化學染色檢測Wnt10b、β-catenin蛋白表達：石蠟切片常規(guī)脫蠟后，1%TritonX-100 4 ℃過夜，3%甲醇+30%過氧化氫室溫孵育15 min，PBS液洗滌3次，應用沸騰的枸櫞酸緩沖液進行抗原修復，PBS液洗滌3次，用5%牛血清白蛋白37 ℃封閉30 min，孵育一抗4 ℃過夜，PBS液洗滌3次，37 ℃孵育二抗30 min，PBS液洗滌3次，DAB顯色，清洗后復染、封片。光學顯微鏡下觀察染色結果，染色呈棕黃色即為陽性表達。200倍光學顯微鏡下取6個高倍視野照相，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析，計算指定區(qū)域面積及該區(qū)域內部特定染色部分的累積光密度，從而得出該區(qū)域內特定染色物的平均光密度。

1.3.6Western blot檢測Wnt10b、β-catenin蛋白表達：將大鼠心肌組織加入裂解液行冰上勻漿，離心取上清，BCA法行蛋白定量，100 ℃水浴變性。提前配置分離膠和濃縮膠，凝固后插入齒梳，加入足夠的電泳緩沖液后上樣電泳，300 mA轉膜。條帶在5%脫脂牛奶中搖床封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，TBST洗3次，室溫孵育二抗2 h，TBST洗3次，ECL顯色，在凝膠成像儀中拍攝條帶圖片并分析灰度值。

正常杵狀棘突在腰椎屈伸時末端會有明顯前后位移，被認為是疼痛根源［4］，但該患者腰部屈伸時無杵狀棘突明顯位移。右L4/L5關節(jié)突關節(jié)區(qū)疼痛及肌肉緊張的原因行腰椎CT平掃及三維重建進一步檢查。CT示L5右側峽部裂（圖2a），L5右半椎板、下關節(jié)突及杵狀棘突與L5其他骨結構分離，形成浮動半椎板，恰如浮動膝［5］或浮動肘［6］，可解釋杵狀棘突為何不隨腰椎屈伸發(fā)生同步位移；同時可見L5/S1椎間盤向右膨出并鈣化，無神經根受壓，右骶棘肌粗大（圖2d，e）。

2 結果

2.1各組大鼠心功能指標比較 與空白對照組比較，模型組LVEF、LVFS降低，LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV及血清CK、CK-MB、BNP均升高(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量參芍口服液組和陽性對照組LVEF、LVFS升高，LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV及血清CK、CK-MB、BNP均降低(P<0.05)。見表1。

表1 6組大鼠心功能指標比較

2.2各組大鼠心肌組織病理學變化 空白對照組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，胞膜、胞核清晰完整，肌絲無斷裂。模型組大鼠心肌細胞可見大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，心肌細胞原有形態(tài)完全消失，大多數呈壞死、變性，可見少量肌纖維母細胞。中、高劑量參芍口服液組和陽性對照組大鼠心肌組織損傷有不同程度改善，可見新生小血管，肌纖維母細胞逐漸增多，聯合呈網絡結構，淋巴細胞及中性粒細胞減少，壞死細胞逐漸消失，膠原纖維增多形成瘢痕組織。見圖1。

圖1 6組大鼠心肌組織病理學變化A.空白對照組，B.模型組，C.低劑量組，D.中劑量組，E.高劑量組，F.陽性對照組；低、中、高劑量組分別予參芍口服液3.2、6.4、12.8 ml/kg

2.3各組大鼠炎性因子水平比較 與空白對照組比較，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量參芍口服液組和陽性對照組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 6組大鼠炎性因子水平比較

2.4各組大鼠心肌組織免疫組織化學染色及Western blot結果比較 免疫組織化學染色和Western blot結果顯示，與空白對照組比較，模型組心肌組織Wnt10b、β-catenin表達顯著升高(P<0.05)；與模型組大鼠比較，中、高劑量參芍口服液組和陽性對照組大鼠心肌組織Wnt10b、β-catenin表達顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織免疫組織化學染色及Western blot結果比較A、B.分別為免疫組織化學染色檢測Wnt10b、β-catenin表達,C.Western blot檢測Wnt10b、β-catenin蛋白表達;1.空白對照組，2.模型組，3.低劑量組，4.中劑量組，5.高劑量組，6.陽性對照組；低、中、高劑量組分別予參芍口服液3.2、6.4、12.8 ml/kg；與空白對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

3 討論

參芍口服液根據中醫(yī)辨證理論配伍，具有活血化瘀、調氣養(yǎng)血等多重功效，對擴張外周血管、改善微循環(huán)具有一定效果，亦能抑制心肌纖維化，具有價格低廉、療效顯著、安全性高等優(yōu)點。本課題組前期研究發(fā)現，參芍口服液具有抗動脈粥樣硬化、調脂、抑制氧化應激和炎癥反應等多種心肌保護機制[12-14]。血管生成是心肌再生的關鍵，瘢痕組織的形成與血管生成密切相關，構成心肌再生的天然屏障，促進血管生成，激活多種可降解膠原的細胞因子[15]。肌纖維母細胞在梗死區(qū)內規(guī)則排列，與心內外膜相連接，具有一定的收縮能力，能防止壞死的心肌膨脹和擴張，維持心功能。本研究發(fā)現給予參芍口服液干預后，鏡下觀察到大鼠心肌組織出現新生小血管及肌纖維母細胞，膠原纖維大量沉積，瘢痕組織形成，大鼠心室結構和心功能也顯著改善，與HE等[16]研究結果類似，表明參芍口服液可促進AMI大鼠心肌組織再生，改善心室結構和心功能。

AMI后的炎癥反應影響梗死范圍和心室重構，被認為是改善AMI患者預后的潛在靶點[17]。AMI后的炎癥反應可分為3個階段，第一階段是釋放損傷相關分子模式蛋白，刺激天然免疫途徑；第二階段是在梗死區(qū)募集中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞；第三階段是炎癥反應消退[18]。AMI后過度持續(xù)的炎癥反應可能會加劇心室重構。本研究發(fā)現，模型組大鼠外周血IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高，而給予參芍口服液干預后上述炎性因子水平降低，與WEI等[19]研究結果一致，表明參芍口服液可降低AMI大鼠外周血炎性因子水平，減輕炎癥反應。

我們基于Wnt信號通路探究參芍口服液保護心肌的作用機制。Wnt信號通路參與心血管的胚胎細胞分裂、增殖、分化，在特定條件下能促進或抑制內皮細胞、心肌細胞的凋亡和死亡[20]。Wnt信號在健康成人器官中大多是沉默的，但在病理條件下通常觀察到Wnt信號被重新激活。在沉默狀態(tài)下，細胞質β-catenin水平較低，防止蛋白質進入細胞核激活基因轉錄，而在激活狀態(tài)下，Wnt結合到卷曲蛋白，激活信號通路，使β-catenin在細胞質中積累，并能與相應的轉錄因子作用，參與肌纖維母細胞、血管內皮細胞等增殖、遷移至梗死區(qū)的過程[21]。本研究發(fā)現，AMI大鼠心肌組織Wnt10b、β-catenin表達上調，而經參芍口服液干預后，大鼠Wnt10b、β-catenin表達下調，與ZOU等[22]研究結果類似，表明參芍口服液可通過調控Wnt/β-catenin信號通路促進心肌組織再生。

綜上，參芍口服液可改善AMI大鼠心室重構和心功能，減輕炎癥反應，促進心肌組織修復與再生，對心肌具有保護作用，這可能與調控Wnt/β-catenin信號通路有關。