小兒輪狀病毒和諾如病毒性腸炎血清PCT、IL-6、SAA水平測定及臨床特征的差異

魯智英，王美芬，彭俊超，杜曾慶，羅云嬌，馬薇

（昆明市兒童醫(yī)院感染性疾病科，云南 昆明 650028）

輪狀病毒（rotavirus，RV）性腸炎和諾如病毒（norovirus，NV）性腸炎是小兒感染性腹瀉最常見疾病，每年約有30～ 50 萬5 歲以下的兒童因脫水、電解質(zhì)紊亂死亡，雖然死亡率較前（1980 年至2015 年）降低80%，但它仍然是發(fā)達(dá)國家及發(fā)展中國家兒童致死率最高的疾病之一[1?2]。由于二者病原體不同，臨床特征相似，接觸間易發(fā)生交叉感染，加重醫(yī)療負(fù)擔(dān)，甚至引起疫情爆發(fā)。糞便病原體檢測是目前最有效的鑒別方法，而本研究規(guī)避了病毒檢測依賴性，通過研究RV 與NV 的臨床特征、實(shí)驗(yàn)室檢查及PCT、IL-6、SAA 水平，分析二者的鑒別因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年11 月至2021 年01 月在昆明市兒童醫(yī)院感染性疾病科住院年齡3 月至48 月的患兒，納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：糞便粘稠度下降（呈松散狀或液體狀）和或排便次數(shù)增加（24 h 內(nèi)排便次數(shù)通常出現(xiàn)3 次或3 次以上），伴或不伴發(fā)熱、嘔吐，同時(shí)排除非傳染性原因。本研究已獲昆明市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 研究方法

（1）臨床資料的收集：收集2 組患兒性別、年齡、臨床癥狀、體征。記錄臨床特征：包括最高體溫（maximum body temperature，maximum BT）和24 h 內(nèi)嘔吐和腹瀉的最多次數(shù)，根據(jù)腹瀉、嘔吐、體溫、脫水和治療的嚴(yán)重程度，采用20 分制Vesikari 評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估病情嚴(yán)重程度[3]。≥11 分被認(rèn)為是病情嚴(yán)重。見表1。標(biāo)準(zhǔn)的治療方案是：補(bǔ)液治療，合適喂養(yǎng)，參與者的所有父母或監(jiān)護(hù)人都表示知情同意。

表1 修正后的Vesikari 量表Tab.1 Modified Vesikari scale

（2）糞便檢測的方法：在患者入院24 h 內(nèi)采集糞便樣本，在病毒檢測前所有的糞便標(biāo)本冷凍在-80 ℃冰箱冷凍保存。①RV 的檢測：取100 mg糞便樣本，采用A 群RV 檢測試劑盒（膠體金法）檢測卡；②NV 的檢測：吸取0.4 mL 糞便標(biāo)本于1.5 mL 離心管中，以12000 r/min 速度離心min，吸取200 μg 標(biāo)本上清液，添加5 μL 內(nèi)標(biāo)進(jìn)行核酸提取，采用NV 核酸檢測試劑盒。由昆明市兒童醫(yī)院專業(yè)人員完成糞便病毒學(xué)的檢測。

（3）炎性指標(biāo)的測定：外周血采用XE-5000全自動(dòng)血液分析儀（日本希森美康公司）測定，白細(xì)胞計(jì)數(shù)（white blood cell，WBC）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（neutrophil count，NEUT），采集所有受試患兒的空腹靜脈血后，以3500 r/min 的速度離心，10 min 后分離血清；用i-CHROMA Reader 免疫熒光分析儀測定血清C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、降鈣素原（rocalcitonin，PCTP）水平（巴迪泰生物科技股份有限公司）、用艾美益免疫熒光分析儀A2000 測定血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A，SAA），羅氏全自動(dòng)電化學(xué)免疫分析儀檢測白介素-6（IL-6，Interleukin-6）。CRP、PCT、SAA、IL-6 檢測最小范圍分別是0.5 mg/L，0.25 ng/L，0.5，1.5 pg/mL。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 25 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，分類資料例數(shù)或百分比采用卡方檢驗(yàn)χ2進(jìn)行比較。所有實(shí)驗(yàn)室檢查運(yùn)用ROC 早期鑒別診斷價(jià)值，多因素分析采用二元Logistic 回歸分析并建立鑒別回歸模型，Hosmer-Lemeshow 檢驗(yàn)判斷模型的擬合優(yōu)度，ROC 分析的曲線下面積（area uder the curve，AUC）評(píng)估模型的診斷效能。根據(jù)約登指數(shù)的最大值確定最佳截?cái)帱c(diǎn)，約登指數(shù)計(jì)算公式:敏感性+特異性-1。P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NV 與RV 臨床特征比較

將年齡、24 h 內(nèi)腹瀉及嘔吐最多次數(shù)、Maximum BT（℃）、Vesikari 評(píng)分作為臨床特征計(jì)量資料，將性別、體溫分界（38 ℃）及Vesikari 評(píng)分分界（≥11 分）人數(shù)、發(fā)生并發(fā)癥（支氣管肺炎、良性驚厥、病毒性腦炎、橫紋肌溶解癥）人數(shù)作為計(jì)數(shù)資料，分別進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)結(jié)果如下。

RV 與NV 組患兒24 h 內(nèi)腹瀉最多次數(shù)、Maximum BT（℃）、Vesikari 評(píng)分，發(fā)熱 >38 ℃人數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；年齡、性別、24 h 內(nèi)嘔吐最多次數(shù)、Vesikari 評(píng)分≥11 分及并發(fā)癥（支氣管肺炎、良性驚厥、病毒性腦炎、橫紋肌溶解癥）人數(shù)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 RV 與NV 組在臨床特征比較/n（%）]Tab.2 Comparison of clinical characteristics between rotavirus and norovirus groups /n（%）]

表2 RV 與NV 組在臨床特征比較/n（%）]Tab.2 Comparison of clinical characteristics between rotavirus and norovirus groups /n（%）]

*P <0.05。

2.2 RV 組和NV 組實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較

RV組與NV 組進(jìn)行WBC、NEUT、CRP、PCT、IL-6、SAA 水平的比較，NEUT、SAA 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002，P<0.01），而WBC、CRP、PCT、IL-6，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

表3 RV 組和NV 組實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較（ ）Tab.3 Comparison of Results of laboratory tests between rotavirus and norovirus groups（ ）

表3 RV 組和NV 組實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較（ ）Tab.3 Comparison of Results of laboratory tests between rotavirus and norovirus groups（ ）

*P <0.05。

2.3 RV 和NV 組實(shí)驗(yàn)室檢測的對(duì)臨床的診斷性能

RV 組與NV 組進(jìn)行血常規(guī)檢查（WBC、NEUT、CRP）及血清PCT、IL-6、SAA 水平鑒別RV 與NV 腸炎，采用ROC 曲線評(píng)估其診斷價(jià)值。NEUT 及血清SAA 水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），AUC 分別為0.778，0.703，見表4，圖1。

圖1 ROC 曲線分析結(jié)果Fig.1 ROC curve analysis results

表4 鑒別RV 和NV 組實(shí)驗(yàn)室檢測的診斷性能Tab.4 Diagnostic performance of laboratory tests for differentiating between rotavirus and norovirus infections

2.4 多因素分析，并建立回歸模型

最終選取年齡、NEUT、SAA、腹瀉及嘔吐24h 內(nèi)最多次數(shù)、maximum BT 納入多因素回歸模型，結(jié)果顯示NEUT、SAA 及maximum BT 是RV及NV 的獨(dú)立鑒別因素（OR=1.824、0.991、3.402，P<0.05），見表5。

表5 RV 與NV 感染鑒別因素的Logistic 回歸分析Tab.5 Logistic regression analysis of clinical predictors in differentiating rotavirus from norovirus infections

對(duì)可能的臨床預(yù)測因子進(jìn)行二元Logistic 回歸分析，發(fā)現(xiàn)maximum BT 和NEUT、SAA 在鑒別RV 和NV 腸炎方面有顯著性意義（P<0.05）。Hosmer-Lemeshow 擬合度較高（P=0.166），總體正確百分比為76.9%。利用這些預(yù)測因子，將RV 與NV 的Logistic 回歸模型定義為：Logit（p）=37.127-0.912 maximum BT -0.193 NEUT-0.009SAA。

2.5 ROC 曲線評(píng)估模型效能

ROC 曲線評(píng)估Logistic 回歸模型的預(yù)測準(zhǔn)確性，AUC 為0.838（95%CI：0.770～0.907P<0.001），見表6，圖1。最大約登指數(shù)（J=0.573），其敏感性為83.6%，特異性為73.7%。

表6 ROC 曲線分析結(jié)果Tab.6 ROC analysis results

3 討論

病毒性腸炎是兒科常見疾病，由腸道病毒感染激發(fā)腸粘膜的分泌機(jī)制引起水樣便[4]為最主要的臨床表現(xiàn)，其次有嘔吐、發(fā)熱，脫水等。RV和NV 在臨床上最常見，其病毒血癥引起腸外損傷，發(fā)生呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等相關(guān)并發(fā)癥。有研究報(bào)道NV 相對(duì)RV 更易引起小兒驚厥[8]，但本研究對(duì)RV 和NV 性腸炎進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)2 組在發(fā)生驚厥方面，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），同時(shí)發(fā)生支氣管肺炎、腦炎、橫紋肌溶解等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可能與研究標(biāo)本數(shù)量相對(duì)較少有關(guān)，需要更多樣本來進(jìn)行研究。RV 潛伏期48～76 h，而NV 潛伏期12～48 h，研究發(fā)現(xiàn)RV 感染的住院患兒并發(fā)NV 感染[5?6]，2 者臨床表現(xiàn)難以區(qū)分[7]，極易發(fā)生交叉感染，加重患兒的病情及醫(yī)療負(fù)擔(dān)，延長住院時(shí)間，甚至導(dǎo)致疫情爆發(fā)。雖然糞便檢查有效簡便，但標(biāo)本采集、兒童配合度及檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)等多方面影響，有必要尋找客觀性更強(qiáng)的量化指標(biāo)提高診斷的準(zhǔn)確性。本研究以RV 和NV 腸炎為研究對(duì)象，規(guī)避病原體檢測對(duì)二者進(jìn)行鑒別。

3.1 Vesikari 評(píng)分及Maximum BT

本研究發(fā)現(xiàn)RV 比NV 感染的嚴(yán)重程度評(píng)分高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011），與Riera-Montes 等[9]研究一致，而本研究的危重評(píng)分高于其報(bào)道，考慮患兒大部分是從各地州輾轉(zhuǎn)就診，其病程及就診方式不同而結(jié)果差異。Vesikari 評(píng)分只能成為臨床病情評(píng)估工具，不能輔助疾病早期鑒別診斷，故未納入多因素分析；本研究中RVVSNV（38.66±0.64 ）vs（37.83±1.08）℃，并以熱峰 >38℃作為分割點(diǎn)，經(jīng)多因素分析結(jié)果顯示，Maximum BT 在38.1℃是二者的獨(dú)立鑒別因素，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這與R?NNELID Y 等報(bào)道NV 比RV 腸炎更易引起嘔吐，而RV 相對(duì)感染引起發(fā)熱比率更高（90%vs86%）相符合[1]。

3.2 NEUT

本研究顯示NEUT 計(jì)數(shù) RV vs NV（7.06±0.85 ）vs（3.94±0.39 ）×109/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05），與Cheng 等[10]在2014 年的研究區(qū)分RV及NV 性腸炎結(jié)果符合。病毒性腸胃炎時(shí)NEUT偏高，考慮病毒感染時(shí)刺激嘔吐中樞，其與交感神經(jīng)毗鄰以刺激引起機(jī)體分泌腎上腺素，動(dòng)員邊緣池的中性粒細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)池，使血中性粒細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)大幅增加。結(jié)合研究中RV 的Vesikari 評(píng)分及Maximum BT 高于NV 感染，不排外RV 更易引起NV 的嘔吐中樞興奮，有待進(jìn)一步研究。

3.3 PCT、IL-6、SAA 水平變化

在機(jī)體急性感染期，血液中很多蛋白質(zhì)，如血清降鈣素原（PCT，Procalcitonin）、白介素-6（IL-6，Interleukin-6）、血清淀粉樣蛋 白A（SAA，Serum amyloid A）都會(huì)升高。本研究RV 和NV 感染的2 種腸炎的對(duì)PCT、IL-6、SAA 變化進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)PCT、IL-6 在2 種腸炎中水平無差異，而血清SAA 水平在RV 組和NV 組均顯著升高，RV 組SAA 水平明顯高于NV 組，2 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3.3.1 PCT 在機(jī)體感染的水平改變PCT 是降鈣素的前肽在感染時(shí)從所有組織（肝臟、脾臟、腎上腺和腸道、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）中釋放，刺激后4 h 內(nèi)開始分泌，8 h 達(dá)到高峰，24 h 半衰期，膿毒癥時(shí)可增長1000 倍，在區(qū)別細(xì)菌感染與病毒感染鑒別效能更高[4]，但PCT 不是評(píng)估細(xì)菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)。有報(bào)道PCT 在部分腸道病毒感染中會(huì)正常或輕度升高[11]，部分病毒性腹瀉合并組織灌注不足、橫紋肌溶解時(shí)PCT 會(huì)明顯升高[12?14]，本組研究中PCT 在RV 組與NV 組2 組中，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3.3.2 IL-6 在炎癥發(fā)生的作用IL-6 是一種常見的促炎細(xì)胞因子，參與刺激B 細(xì)胞和T 細(xì)胞的增殖。當(dāng)炎癥觸發(fā)時(shí)，部分IL-6 由IL-1b 和TNFa 誘導(dǎo)進(jìn)入血液循環(huán)（通過中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，以及感染或損傷部位的駐留細(xì)胞），刺激肝臟產(chǎn)生CRP 和其他急性期蛋白（如血清淀粉樣蛋白P成分、SAA、纖維蛋白原、鐵蛋白）并釋放入血，起到促炎、抗炎及修復(fù)作用[15]，本研究中IL-6在2 組中，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3.3.3 SAA 在病毒感染中的改變SAA 是人類主要的急性期蛋白之一，屬于載脂蛋白，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在急性感染8～24 h 后，A-SAA（SAA1和SAA2）可以增加1000 倍以上。SAA 比CRP、PCT 更敏感，在病毒感染時(shí)會(huì)急劇增高[16]，刺激產(chǎn)生免疫細(xì)胞的趨化因子和IL-1，IL-10 等[17]，將免疫細(xì)胞（例如單核細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，未成熟樹突狀細(xì)胞，T 細(xì)胞和肥大細(xì)胞）募集到組織中防止病原體入侵，通過抑制細(xì)菌粘附上皮細(xì)胞達(dá)到直接抗菌，在宿主細(xì)胞抗病毒活性中起到重要作 用[18?20]。而在本研究中，RV組和NV 組血清SAA 水平均顯著升高，RV 組SAA 水平明顯高于NV 組，反映了急性RV 感染時(shí)的抗炎效應(yīng)，RVVSNV（62.72±9.72）vs（26.49±6.52）mg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），多因素分析顯示SAA是鑒別二者的獨(dú)立因素。

3.4 RV 與NV 感染的臨床研究鑒別

鑒別RV 與NV 組的Logistic 回歸模型本研究對(duì)住院143 例患兒為研究對(duì)象，其中RV 76 例，NV 67 例進(jìn)行分析，選取年齡，24 h 內(nèi)嘔吐、腹瀉最多次數(shù)，maximum BT，NEUT，SAA 等連續(xù)變量作為潛在的預(yù)測因子，結(jié)果顯示SAA、NEUT 及maximum BT 具有獨(dú)立鑒別因素，與臨床工作一致，與R?NNELID Y 等[1]研究NV 相對(duì)RV 感染年齡段不同，甚至NV 感染在嘔吐、腹瀉及脫水征癥狀更重，與本研究存在差異。

3.5 ROC 曲線評(píng)估二元Logistic 回歸模型的鑒別效能

ROC 曲線分析評(píng)估WBC、NEUT、CRP、IL-6、PCT、SAA 水平在RV 感染與NV 感染鑒別中的診斷價(jià)值，SAA（AUC 0.703，P=0.0075）、NEUT（AUC 0.778，P<0.001）比PCT、IL-6 更有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)二者早期鑒別更有價(jià)值。逐步引入Logistic 回歸，該模型最大的尤登指數(shù)作為截?cái)嘀担浩渲衜aximum BT38.1 ℃，NEUT 5.46×109/L，SAA 為42.07 mg/dL。ROC 曲線分析預(yù)測模型的準(zhǔn)確性，在最佳截?cái)嘀诞a(chǎn)生了高靈敏度（83.6%）和特異性（73.7%）。三者結(jié)合的模型診斷效能AUC 值明顯高于maximum BT，NEUT 及SAA（0.838 vs 0.751 vs 0.778 vs 0.703）獨(dú)立鑒別因素，說明該模型對(duì)RV 與NV 性腸炎有一定的鑒別價(jià)值。

綜上所述，RV 與NV 性腸炎相比，RV 患兒病情更重，單日內(nèi)腹瀉次數(shù)更多，體溫 >38℃人數(shù)更多。在病毒檢測受限條件下，基層兒科醫(yī)生可根據(jù)maximum BT，NEUT 及SAA 綜合評(píng)估可以協(xié)助2 種腸炎的鑒別。

由于本研究納入對(duì)象為住院患兒，其臨床癥狀相對(duì)較重，可能存在選擇總體偏倚；其次由于采血時(shí)間、離心后標(biāo)本的保存等因素，可能會(huì)影響血清炎癥因子水平；再次，本研究中僅檢測RV 及NV，未檢測腺病毒和星狀病毒，不能排除混合感染對(duì)本研究結(jié)果影響。未來的研究中，進(jìn)一步擴(kuò)大標(biāo)本的數(shù)量及進(jìn)行其他類型腸道病毒的檢測，減少對(duì)研究結(jié)果的影響。