Smad4 與嗅覺系統功能及疾病的研究進展

張 切 ，王淑芬 ，曹守明 ，吳海鶯

（1）昆明醫科大學第二附屬醫院耳鼻咽喉科,云南 昆明 650101;2）昆明醫科大學生物醫學工程研究中心云南省干細胞和再生醫學重點實驗室,云南 昆明 650500）

嗅覺系統不僅是人類進化史上最古老的感官之一，也是人類出生后就即刻使用的感官之一[1]。嗅覺不僅包括辨別氣味，還包括對信息素的編碼，從而起著預警危險、影響食欲、調節情緒等作用。嗅覺系統如果受到損傷，會直接影響患者的生活質量，嚴重的還會給患者的精神狀態造成負面影響。深入了解SMAD4 在嗅覺系統及其在嗅覺相關疾病中的作用，不僅有助于在微觀領域揭示嗅覺相關基因的功能，而且能為下一步對信息素、鼻腔腫瘤等的研究提供有效的參考和重要的啟示。

1 Smad4 簡介

人類的Smad4 位于染色體 18q21.1 上。目前已知的Smads 蛋白至少有9 種，即Smad1～Smad9。其中Smad4 蛋白由552 個氨基酸殘基組成的[2]。Smad4 蛋白的肽鏈中包含N 區（MH1，mad homology domain 1）和C 區（MH2，mad homology domain 2）。Smad4 蛋白的MH2 能夠結合受體 激酶[2]。SMAD4 是TGF-β 信號通路的中心調節因子，而TGF-β 信號通路在細胞生長、分化、凋亡、遷移以及癌癥的發生和發展等許多生物學過程中發揮著重要作用，SMAD4 作為一種腫瘤抑制因子在多種癌癥中發揮重要作用。

2 SMAD4 與嗅覺系統的功能

2.1 嗅覺系統的結構

主嗅系統（Main olfactory system）和副嗅系統（Accessory olfactory system）是嗅覺系統的2 大組成部分。主嗅系統包括嗅上皮、嗅球、嗅覺皮層；副嗅系統即犁鼻系統或犁鼻器（Vomeronasal organ），包括 Apical 和 Basal 犁鼻骨感覺神經元和副嗅球[3]。嗅覺感覺神經元和犁鼻感覺神經元的信息傳遞的具有互補特征。嗅覺感覺神經元的階段性放電適用于在較短的周期（<200 ms）內攜帶有關快速變化的信息。相比之下，犁鼻感覺神經元的強直放電能夠傳達關于較小刺激隨著較長周期（>500 ms）緩慢變化的信息。因此，這2 種感覺神經元的平行通路可以傳達有關各種動態刺激的信息。嗅覺信息傳遞的互補特征的組合可以增強主要嗅覺系統和犁鼻系統之間相互作用的協同作用[4?5]。

2.2 嗅覺的產生機制

嗅覺的產生依賴于氣味分子與嗅覺受體的結合。嗅覺受體存在于嗅神經元上，是一種G 蛋白偶聯受體（Golf）。空氣中的化學物質通過呼吸，被嗅上皮部分的黏液吸收，直接或間接地與嗅覺受體結合。盡管嗅覺受體與氣味分子并非是一對一識別的關系，同一個氣味分子會拆解為多個部分分別被多個嗅覺受體識別[1]。嗅覺受體屬于氣味分子與嗅覺受體結合后激活 Golf，活化的Golf進一步激活腺苷酸環化酶Ⅲ，提高胞內第二信使環磷酸腺苷（cAMP）濃度，從而打開細胞膜上的環核苷酸門控陽離子通道，引起鈣離子內流、氯離子外流，導致細胞去極化，行成動作電位，動作電位再通過嗅絲傳導至嗅球[6]。嗅小球將動作電位傳遞，激活嗅球上的神經元，即僧帽細胞。接著嗅束把信息傳遞到更高的主嗅系統組成部分，即嗅覺皮層，便產生了嗅覺[5]。

嗅覺系統與邊緣系統關系緊密。嗅球會將匯總的氣味信息投射至海馬體（喚起與該氣味有關的記憶）、投射至杏仁核（調出該氣味“好壞”的標簽）。嗅覺刺激的產生除了氣味分子之外，還有信息素（又稱費洛蒙）。不同的物種，其接受信息素和一般氣味分子的編碼可能由犁鼻器和嗅上皮分別進行，也可能同時由兩者編碼[7?8]。目前已知的如外分泌腺分泌肽22 由犁鼻器編碼；甲硫基甲硫醇、雄烯酮這些信息素由主嗅覺系統編碼。對于人類的性信息素，目前僅有雄甾二烯酮和雌甾四烯[9?15]被認為很可能是有用的人類性信息素。人類嗅覺對不同信息素的心理和生理反應也可能不太一樣。已經有越來越多的證據表明人類信息素的存在，但其潛在的機制仍然不清楚。特別是在嗅覺系統如何編碼信息素從而進一步對人類產生影響，還有很多值得研究的地方。

2.3 SMAD4 與嗅覺神經的關系

2.3.1 Smad4 信號通路與犁鼻感覺神經元（VSN）的關系Smads 基因存在于細胞質中，是哺乳動物體內TGF-β 信號轉導途徑中的重要基因家族，是已被證實的 TGF-β 受體激酶的底物。Smads可將信號由細胞膜直接傳至細胞核。目前已知至少存在9 種Smads 分子，按結構和功能可分為3個亞型：受體激活型、通用型、抑制型。Smad4屬于通用型，能與活化的 R-Smad 形成異聚體，在信號轉導中發揮關鍵作用[4]。Smad4 基因編碼的蛋白可以被跨膜絲氨酸/蘇氨酸受體激酶激活，如轉化生長因子 TGF-β 受體。Smad4 作為 TGFβ 信號的重要胞漿內信號級聯分子，能夠以同源復合物或者異源復合物的形式，轉移到核內。同時，SMAD4 會與其他轉錄因子協同作用，調節TGF-β 應答基因的轉錄。Smad4 的表達或功能的改變，都會使TGF-β 的信號轉導出現異常，甚至是影響腫瘤的形成過程[16?18]。

Smad4 信號在 basal-VSN 的成熟、功能和精確連通性方面起著關鍵作用，Smad4 的突變會導致 TGF-β/BMP 信號通路破壞，引起 basal-VSN的進行性功能缺失，減少對 basal-VSN 的激活，導致后部副嗅球形成的異常，導致嗅覺傳導異常[4?19]。

2.3.2 Smad4 介導的信號驅動了基礎犁鼻感覺神經元（VSN）的功能成熟和連接2020 年，Ankana S.Naik 等[20]為了測試 TGF-β/BMP 信號在不同細胞環境中的作用，利用AP-2εCre 和OMPCre小鼠系作為破壞Smad4 功能的基因切入點，分別破壞未成熟基底 VSN 和成熟頂端和基底 VSN 中的Smad4 功能。結果表明未成熟基底VSN 中Smad4 依賴性形態發生信號是完成基底VSN 細胞成熟所必需的，并且未成熟和成熟基底VSN 中的Smad4 依賴性信號對于基底VSN 和AOB 之間的正確電路形成至關重要。成熟的基底VSN 中的條件Smad4 消融導致成年小鼠基底神經元的嚴重損失，并且損害神經元對氣味刺激的反應[20?21]。

2.3.3 Smad4 對人類嗅覺系統的影響SMAD4作為經典的轉錄調控因子，本身在TGF-β 信號轉導通路中發揮重要的調控作用，但也有SMAD4對可變剪接潛在的調控作用，在siRNA 的作用下誘導Bim 的可變剪接短亞型的表達的觀點。嗅覺神經發育相關的高通量測序數據表明嗅覺投射神經元（傳遞嗅覺信息到腦高級區域）發育過程中可變剪接水平存在廣泛的變化，WT1 的可變剪接亞型（+KTS）的表達對于嗅覺上皮的發育具有重要的促進作用。另一方面，由于目前人類嗅覺系統對信息素的編碼尚未有定論，人類對信息素的編碼可能有的發生在副嗅覺系統，有的則發生在主嗅覺系統，因此SMAD4 很可能還會通過對嗅覺神經的調控影響對信息素的編碼從而影響人類的行為，特別是生殖和社會行為。

信息素這種化學信號在同一物種的成員之間傳遞信息，它們與中樞神經系統和神經內分泌系統之間錯綜復雜的相互作用則不太為人所知。在關于人類信息素的研究結果中，自1971 年第1 份關于人類月經同步的報告以來，近50a 的研究表明，人體分泌物，特別是腋下汗水，潛意識地傳達情感和生殖狀態，反過來又由復雜的神經化學變化驅動。在人體分泌物的許多成分中，雄甾二烯酮（androsta-4，16，-dien-3-one，一種性腺孕酮的非雄激素衍生物）和雌甾四烯（estra-1，3，5（10），16-tetraen-3-ol，與雌激素性激素有關但沒有已知的雌激素作用），這2 種內源性類固醇是人類性信息素的候選者[22]。國外有研究團隊進一步根據研究成果總結出人類的4 類信息素[23]。第1 種引發快速而可靠的行為，稱為直效信息素Releaser pheromone）。第2 種是使吸入該種信息素的對象內分泌發生的變化的啟動信息素（Primer pheromone）。第3 種為通訊信息 素（Signaler pheromone），它能傳遞釋放者的關鍵信息。第4種是調節信息素（Modulator pheromone），是可以使接收者的情緒起伏乃至認知發生變化的信息素，如：焦慮狀態下分泌的汗液能夠消除閾下積極面部表情所產生的情緒啟動效應[23?24]，同時使驚跳反射變得強烈[23]；研究對象的情緒會受到不同狀態下分泌的汗液氣味的影響，例如聞到恐懼狀態下分泌的汗液不僅情緒知覺會變化，其反應也會變慢[24?25]；聞到厭煩或開心狀態下分泌的汗液，其面部表情、呼吸甚至認知反應都會有相應的改變[26?27]。更有研究發現，沒有明顯氣味的人的眼淚也可能包含信息素，并影響接收者的生理狀態[28]。

3 SMAD4 與嗅覺相關腫瘤的關系

3.1 SMAD4 與腫瘤的關系

如前所述，Smad4 蛋白可與TGF-β 上的TGF-β I 型受體相結合，并將其激活。TGF-β是重要的轉錄生長因子，具有調控細胞增殖的作用。當Smad4 的核表達缺失時，TGF-β 信號會發生斷裂，使腫瘤細胞擺脫 TGF-β 的調控，從而可導致腫瘤細胞出現不可逆的異常增殖和生長[29]。目前已有的研究均一致認為SMAD4 是一種抑癌基因。如在食管癌、胃癌、結直腸癌等消化道腫瘤中，多數研究表明Smad4 常常發生基因變異[30?31]。其具體的機制包括：Smad4 的點突變可通過 GSK-3 的磷酸化作用從而可逆地使TGFβ 信號失活；Smad4 可抑制VEGF-C 的分泌，并抑制淋巴管的生成，從而降低腫瘤的轉移及侵襲能力；TGF-β 通過SMAD4 及SP1 協同轉錄上調LAMC1 的表達；體外功能實驗也顯示，LAMC1通過抑制凋亡促進腫瘤細胞增殖，且通過激活Akt/NF-κB/MMP9，MMP14 促進腫瘤細胞遷移[32]。大量的臨床研究證實，SMAD4 可作為診斷、治療消化道腫瘤及評估消化道腫瘤患者預后的重要標志物。在與女性生殖系統腫瘤的研究中，發現在體外試驗中，SMAD4 可抑制體外部分乳腺癌細胞的生長[33]；在乳腺癌細胞株MCF-7 和MDA-MB-468 中，SMAD4 既可單獨，也可通過與SMAD3形成復合物的形式呈劑量依賴性抑制ERα介導的轉錄活性[33]。已有研究表明[33]，CIN 和宮頸鱗癌中SMAD4 表達異常（表達減少），可使TGF-β信號傳導減弱或中斷，導致相關的生長抑制作用受抑制。因此細胞連續增殖，進而誘發CIN，甚至癌變[33]。Mackenzie 等[34]研究發現，黏液性卵巢癌存在低水平的Smad4 基因突變，并且BMP9（骨形態發生蛋白9）可通過ALK2/ActRIIA/BMPRII/ Smad1/ Smad4 途徑誘導卵巢癌細胞增殖。在肺癌中發現了Smad2 和Smad4 在18q21 上存在不良突變[35]，TGF-β1 基因多態性與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）風險的增加有關[36]。

3.2 SMAD4 與與嗅覺相關腫瘤

鼻腔鼻竇惡性腫瘤少見，僅占頭頸部惡性腫瘤的3%～5%。而且病理類型繁多主要包括嗅神經母細胞瘤、鱗癌、腺癌、未分化癌、神經內分泌癌、惡性黑色素瘤、腺樣囊性癌、血管周細胞瘤、淋巴瘤和軟組織肉瘤等[37]。目前有研究表明與SMAD4 有關的鼻腔鼻竇惡性腫瘤有嗅神經母細胞瘤（factory neuroblastoma，ONB）[38]。ONB 又稱嗅神經細胞瘤、神經上皮瘤或成感覺神經母細胞瘤等，是一種罕見的、局部侵襲性、起源于嗅上皮的惡性腫瘤。由于發病率較低（0.4/100 萬，占所有鼻腔腫瘤的2%～3%）且早期癥狀不典型，相關的研究較少。ONB 確切起源存在爭議，目前普遍認為其來源于嗅神經上皮基底細胞，最常見的原發部位為鼻腔頂篩板區。2017 年Topcagic J等[39]對23 例復發或轉移性ONB 患者（10 例男性，13 例女性，年齡29～84 歲）的樣本進行基因檢測，發現在63%的標本中檢測到突變，包括 TP53、CTNNB1、EGFR、APC、cKIT、cMET、PDGFRA、CDH1、FH 和 SMAD4 基因。

從目前的研究進展來看，一方面，盡管目前發現的SMAD4 與嗅覺特別是嗅覺障礙之間的關系主要是來自動物實驗，且對嗅覺的影響主要通過副嗅系統，而人類的副嗅系統已處于退化。然而目前人類嗅覺系統對信息素的編碼尚未有定論，人類對信息素的編碼可能有的發生在副嗅覺系統，因此SMAD4 很可能還會通過對嗅覺神經的調控影響對信息素的編碼從而影響人類的行為，因此深入了解SMAD4 在嗅覺神經系統中的調控作用，不僅有助于在微觀領域揭示嗅覺相關基因的功能，而且能為下一步對信息素的研究提供有效的參考和重要的啟示。另一方面，盡管已經明確SMAD4是一種抑癌基因，但由于鼻腔鼻竇惡性腫瘤少見，用于全面大規模研究的腫瘤組織樣本有限，對其遺傳學、分子生物學或發病機制知之甚少，然而識別這些腫瘤的分子異常對特異性靶向治療的研究至關重要。因此SMAD4 在鼻腔鼻竇惡性腫瘤中的作用機制還有待進一步研究且意義深遠。