基于AAT 與細(xì)胞因子構(gòu)建活動性肺結(jié)核的Nomogram 預(yù)測模型

樊 浩 ，劉幸 ，沈凌筠 ，李海雯 ，余春紅 ，李婧煒

（1）大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000;2）云南省傳染病臨床醫(yī)學(xué)中心/昆明市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，云南 昆明 650301）

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性傳染性疾病，主要累及肺部又稱肺結(jié)核（pulmonary tuberculosis，PTB）。活動性肺結(jié)核是指MTB 經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查證實(shí)有活動性依據(jù)的結(jié)核病，由于排菌肺結(jié)核患者攜帶的MTB 傳染性較強(qiáng)，嚴(yán)重威脅人們的生命健康，目前已成為嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題[1]。據(jù)統(tǒng)計2021 年我國新發(fā)肺結(jié)核人數(shù)約86 萬，遠(yuǎn)超新冠肺炎患病人數(shù)，僅次于印度，是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[2?3]，有研究發(fā)現(xiàn)近年來菌陰肺結(jié)核患者顯著增加[4]，而國內(nèi)外診斷肺結(jié)核的“金標(biāo)準(zhǔn)”則是在患者的痰培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌[5]，菌陰肺結(jié)核患者數(shù)量增加勢必導(dǎo)致痰培養(yǎng)檢出率下降。同時還存在痰培養(yǎng)周期長、實(shí)驗(yàn)要求較高等限制[6?7]，病原學(xué)檢查明顯不能滿足臨床需求。但截止目前，臨床上尚無高效的生物標(biāo)志物用于活動性肺結(jié)核的判斷，因此尋找準(zhǔn)確、簡便、快捷的實(shí)驗(yàn)室診斷方法對活動性肺結(jié)核的早期診治至關(guān)重要。

目前針對肺結(jié)核早期診斷的研究成為臨床研究的熱點(diǎn)，有研究表明活動性肺結(jié)核患者外周血中的白介素（Interleukin）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、干擾素誘導(dǎo)蛋白（Interferon-inducible protein）等細(xì)胞因子都顯著升高，當(dāng)急性期時，機(jī)體吞噬細(xì)胞水平顯著增加[8?9]，其中吞噬細(xì)胞分泌的TNF-α 細(xì)胞因子能刺激機(jī)體局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體觸珠蛋白（haptoglobin，HAP）、α1 抗胰蛋白酶（α1 antitrypsin，AAT）、α1 酸性糖蛋白（α1 acid -glycoprotein，AGP）3 者的水平異常升高[10]，因此臨床上多考慮其與機(jī)體炎癥創(chuàng)傷有關(guān)，并可用于鑒別急性、亞急性與慢性病理狀態(tài)，在一定程度上與機(jī)體損傷的性質(zhì)和范圍也相關(guān)。本研究擬通過檢測活動性肺結(jié)核外周血中AGP、AAT、HAP及細(xì)胞因子水平，探索其在活動性肺結(jié)核中的應(yīng)用價值，并建立簡便可靠的Nomogram 預(yù)測模型，為活動性肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室診斷提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性納入昆明市第三人民醫(yī)院2020 年3 月至2021 年3 月收治的活動性肺結(jié)核患者96 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）診斷標(biāo)準(zhǔn)均按照：《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》（WS288-2017）[11]；（2）實(shí)驗(yàn)組患者經(jīng)影像學(xué)檢查（包括多發(fā)性結(jié)節(jié)狀病灶，片狀、云絮狀及大葉性肺實(shí)變，團(tuán)塊狀陰影，以及肺門或縱隔淋巴結(jié)增大等）和組織病理學(xué)檢查（典型病變是肉芽腫伴干酪樣壞死及結(jié)核結(jié)節(jié)形成，外周有纖維結(jié)締組織和慢性炎性細(xì)胞浸潤，周邊可見朗罕細(xì)胞）后，均確診為活動性肺結(jié)核；（3）痰標(biāo)本病原學(xué)陽性肺結(jié)核者，對于痰標(biāo)本病原學(xué)檢測（包括涂片、培養(yǎng)和分子生物學(xué)檢測等）為陰性的肺結(jié)核患者，采用BALF 和支氣管鏡下活檢技術(shù)，進(jìn)一步獲取病原學(xué)和病理學(xué)證據(jù)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）屬于非結(jié)核分枝桿菌肺病；（2）合并心、腎、肝等重要臟器性疾病；（3）免疫系統(tǒng)疾病；（4）凝血功能障礙；（5）妊娠期、哺乳期婦女；（6）肺外結(jié)核如：胸膜結(jié)核、骨關(guān)節(jié)結(jié)核等。本研究經(jīng)昆明市第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有入選患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

按是否患有活動性肺結(jié)核進(jìn)行分組，患有活動性肺結(jié)核的患者為實(shí)驗(yàn)組，同期健康體檢者為對照組，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)共納入96 例患者作為實(shí)驗(yàn)組，同期健康體檢者82 例作為對照組，2 組基線資料，性別、年齡、體重指數(shù)等，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.3 儀器及試劑

主要儀器：奧林巴斯全自動生化分析儀（型號：AU680，來源：美國貝克曼生物科技有限公司），流式細(xì)胞儀（型號：Bircyte E6，來源：深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。主要試劑：細(xì)胞因子檢測試劑盒（批號：210603，來源：青島瑞斯凱爾生物科技有限公司），AGP、AAT、HAP 檢測試劑盒（批號：0320/04912、0124/05402L1、9033/03246L1，來源：迪亞萊博生物科技有限公司）。

1.4 研究方法

對入院后的研究對象采集靜脈血2 mL 于EDTA-K2 抗凝劑的真空管中，充分混勻送至實(shí)驗(yàn)室檢測，檢測項(xiàng)目有：AGP、AAT、HAP、IgG、IgA、IgM、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、IFN-γ、IFN-α、TNFα、CD3、CD4、CD8、CD4+/CD8+、CD45+、Bcell、CRP、NK-cell，標(biāo)本檢測操作方法均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，在質(zhì)量控制合格后完成，通過流式細(xì)胞儀Bircyte E6，全自動生化分析儀AU680 完成。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理軟件采用 SPSS Statistics 17.0 統(tǒng)計軟件。服從正態(tài)分布的以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，選擇t檢驗(yàn)；不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]，選擇秩和檢驗(yàn)；將單因素分析中P<0.05 的變量，使用多因素Logistic 回歸分析，根據(jù)分析結(jié)果確定活動性肺結(jié)核發(fā)生的獨(dú)立危險因素。基于多因素分析結(jié)果，應(yīng)用R 軟件中的rms 和pROC 安裝包建立Nomogram 預(yù)測模型，根據(jù)計算結(jié)果繪制ROC 曲線，從而評估預(yù)測模型對活動性肺結(jié)核的預(yù)測價值，并繪制校準(zhǔn)圖。

2 結(jié)果

2.1 活動性肺結(jié)核患者的單因素分析

26 個因素中IgG 指標(biāo)檢測數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，采用經(jīng)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。其余指標(biāo)檢測數(shù)據(jù)分布不服從正態(tài)分布，采用秩和檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，與對照組相比實(shí)驗(yàn)組以下10個指標(biāo)IgA、HAP、AGP、AAT、IL-6、IFN-γ、IFN-α、CD4、NK-cell、CRP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），是發(fā)生活動性肺結(jié)核的影響因素，見表1。

表1 活動性肺結(jié)核患者指標(biāo)的單因素分析 [（ ）/M（P25，P75）]Tab.1 Univariate analysis of indicators in patients with active tuberculosis [（ ）/M（P25，P75）]

表1 活動性肺結(jié)核患者指標(biāo)的單因素分析 [（ ）/M（P25，P75）]Tab.1 Univariate analysis of indicators in patients with active tuberculosis [（ ）/M（P25，P75）]

與對照組相比，*P <0.05，**P <0.01。

2.2 活動性肺結(jié)核患者指標(biāo)的多因素Logistic 回歸分析

將單因素分析結(jié)果中，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）的10 個相關(guān)因素作為自變量，見表2，將是否發(fā)生活動性肺結(jié)核作為因變量（0=有活動性肺結(jié)核，1=無活動性肺結(jié)核），采用向前逐步回歸法，進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，最終結(jié)果顯示AAT（OR=0.983，95%CI=0.968～0.999，P=0.039），IFN-γ（OR=0.783，95%CI=0.659～0.931，P=0.006），TNF-α（OR=1.495，95%CI=1.106～2.020，P=0.009）均與活動性肺結(jié)核發(fā)生的明顯相關(guān)（P<0.05），其中TNF-α 的OR>1，P<0.05，為活動性肺結(jié)核的預(yù)測因子，見表3。

表2 發(fā)生活動性肺結(jié)核危險因素及其賦值Tab.2 Risk factors for developing active pulmonary tuberculosis and their value assignments

表3 活動性肺結(jié)核患者指標(biāo)的多因素Logistic 回歸分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of indicators in patients with active tuberculosis

2.3 列線圖預(yù)測發(fā)生活動性肺結(jié)核風(fēng)險

根據(jù)因素Logistic 回歸模型計算結(jié)果，應(yīng)用R 軟件中的Nomogram 模型對各影響因素進(jìn)行評分，每個預(yù)測指標(biāo)刻度線的數(shù)值即為所得分?jǐn)?shù)，總得分為所有指標(biāo)相應(yīng)的分?jǐn)?shù)相加，總得分代表發(fā)生活動性肺結(jié)核的風(fēng)險。由列線圖可知在此模型中IFN-γ 是發(fā)生活動性肺結(jié)核的最強(qiáng)預(yù)測因子，然后是TNF-α 和AAT，見圖1。

圖1 活動性肺結(jié)核危險因素Nomogram 預(yù)測模型圖Fig.1 Nomogram predictive model diagram of active tuberculosis risk factors

2.4 列線圖的檢驗(yàn)

采用自助法（Bootstrap）對列線圖模型進(jìn)行驗(yàn)證，其中ROC 曲線的分析結(jié)果顯示：曲線下面積為0.728（95%CI：0.655～0.801），說明本模型預(yù)測能力良好，見圖2。Nomogram 預(yù)測模型校準(zhǔn)圖結(jié)果顯示，校準(zhǔn)預(yù)測曲線與理想曲線貼合良好，說明該模型有良好的預(yù)測精準(zhǔn)度及區(qū)分度，見圖3。

圖2 Nomogram 預(yù)測模型的ROC 曲線Fig.2 ROC curve of the Nomogram prediction model

圖3 Nomogram 預(yù)測模型的校準(zhǔn)圖Fig.3 Calibration diagram of the Nomogram prediction model

3 討論

我國的肺結(jié)核疫情十分嚴(yán)峻，活動性判斷是肺結(jié)核的診治中不可或缺的環(huán)節(jié)[12]，目前臨床上的“金標(biāo)準(zhǔn)”存在諸多不足，如假陰性或假陽性率高等問題，尋找新的活動性評價標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫。臨床上對于活動性肺結(jié)核的診斷主要通過實(shí)驗(yàn)室及病理學(xué)檢查，無法進(jìn)行大規(guī)模檢測，不利于阻止肺結(jié)核的傳播，而通過列線圖模型可以將發(fā)病風(fēng)險及高危因子進(jìn)行量化，更加精準(zhǔn)、直觀的用數(shù)字表現(xiàn)出活動性肺結(jié)核患病風(fēng)險的概率，通過監(jiān)測高危因子能有效篩查活動性肺結(jié)核患者，阻止肺結(jié)核的傳播，目前我國外周血檢測技術(shù)越來越成熟，已具備大規(guī)模篩查的能力。同時活動性肺結(jié)核患者外周血指標(biāo)的研究愈來愈熱，活動性肺結(jié)核患者外周血中CD44 與健康人群相比表達(dá)水平明顯增高，當(dāng)CD44 表達(dá)水平異常時，患者血清中TNF-α 和IFN-γ 表達(dá)水平也異常增高[13]。同時患者血漿中 IL-6，IL-17，IL-37 及TIM-3 水平也有明顯升高的趨勢[14]。程靜等[15]對活動性肺結(jié)核患者肺泡灌洗液進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)，患者血清中IFN-γ、IL-12、IL-35 水平明顯升高，這些證據(jù)都表明細(xì)胞因子對肺結(jié)核活動性評價具有重要意義。

近年來牛文一、鄭梓坤等[16?19]通過對比活動性患者與健康人群外周血中的細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子，進(jìn)行單因素方差分析得出CD3、CD4 以及血清中IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-17 對活動性肺結(jié)核診斷具有一定的價值，但大部分研究納入的指標(biāo)單一，很難做出準(zhǔn)確的判斷，因此有必要建立準(zhǔn)確、客觀的活動性肺結(jié)核診斷預(yù)測模型。為此本研究提出一種基于AAT 與細(xì)胞因子構(gòu)建活動性肺結(jié)核的預(yù)測模型方案，考慮到活動性肺結(jié)核是一個復(fù)雜的、多因素、多系統(tǒng)的病變過程[20]，本研究納入活動性肺結(jié)核患者的26 項(xiàng)指標(biāo)，將單因素分析結(jié)果進(jìn)行二元Logistic 回歸分析，以期能快速識別肺結(jié)核患者的活動性，便于患者早期臨床診治，提高患者的預(yù)后及生存率。

與其他研究相對比，本研究基于單因素分析結(jié)果中具有統(tǒng)計學(xué)差異的相關(guān)因素進(jìn)行邏輯回歸分析，并對分析結(jié)果納入列線圖模型，其研究結(jié)果顯示TNF-α、IFN-γ、AAT 均是活動性肺結(jié)核的預(yù)測因子。當(dāng)TNF-α 異常時，會改變中性粒細(xì)胞（NE）的吞噬能力，促進(jìn)NE 粘附到內(nèi)皮細(xì)胞上，刺激機(jī)體產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)[21]，引起慢性炎性細(xì)胞浸潤，誘發(fā)患者多發(fā)性結(jié)節(jié)狀病灶的產(chǎn)生，屬于活動性肺結(jié)核患者影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時使AAT 的水平異常升高，這可用于區(qū)分急性、亞急性與慢性肺結(jié)核。IFN-γ 則是Th1型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，這類細(xì)胞因子能夠增加巨噬細(xì)胞的活性[22?23]，對活動性肺結(jié)核的發(fā)展具有非常重要的影響。IFN-γ 釋放實(shí)驗(yàn)也是確認(rèn)病原體感染較為可靠的方法，具有早期診斷價值[24?25]。研究結(jié)果表明相較于其他臨床指標(biāo)，TNF-α、IFN-γ、AAT 3 者更具有特異性，對于活動性肺結(jié)核診斷具有重要的價值。

為了建立量化的活動性肺結(jié)核風(fēng)險預(yù)測模型，對患者患病風(fēng)險進(jìn)行評估，識別活動性肺結(jié)核高危人群，實(shí)現(xiàn)早期治療，改善肺結(jié)核的預(yù)后。本研究將回歸分析結(jié)果利用Nomogram 預(yù)測模型使預(yù)測結(jié)果可視化，使預(yù)測模型更具可讀性。本次研究中，列線圖檢驗(yàn)結(jié)果顯示，C-index 指數(shù)為0.728（95%CI：0.655～0.801），說明本研究所列Nomogram 模型具有較好的區(qū)分度與精準(zhǔn)度。同時外部驗(yàn)證結(jié)果顯示校準(zhǔn)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線有較好的擬合度，證實(shí)預(yù)測值與實(shí)際值一致性較高，表明本模型有較高的預(yù)測準(zhǔn)確率。同時在后續(xù)研究中將收集更多的外部數(shù)據(jù)對該模型的準(zhǔn)確率進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究尚不足之處：（1）血清學(xué)檢查作為肺結(jié)核活動性的判斷證據(jù)級別較低，臨床應(yīng)用時需結(jié)合影像學(xué)檢查和患者臨床癥狀進(jìn)行綜合判斷；（2）活動性肺結(jié)核主要引起感染、炎癥改變等不典型性癥狀，這導(dǎo)致容易受患者免疫功能狀況影響；（3）本研究中應(yīng)用的是Nomogram 模型，只是眾多疾病預(yù)測模型中的一種，在接下來的工作中，本課題組將對患者進(jìn)行隨訪，同時擴(kuò)大樣本量，開展多中心研究，建立不同方法組合的模型，構(gòu)造適用范圍更廣、更加準(zhǔn)確的預(yù)測模型。

綜上所述，活動性肺結(jié)核是一個復(fù)雜的、多因素、多系統(tǒng)的病變過程[26]，其活動性的評價需從多方面進(jìn)行考證。經(jīng)檢驗(yàn)AAT、IFN-γ、TNFα 指標(biāo)異常均與活動性肺結(jié)核的發(fā)生明顯相關(guān)，基于上述危險因素建立的Nomogram 模型具有良好的預(yù)測效能，可為活動性肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室診斷提供一定的參考價值。