一例豬細小病毒2型和3型混合感染的實驗室診斷

拉馬甲甲，張 陽，徐志文*

（1.四川省喜德縣農業農村局，四川 喜德 616750；2.四川農業大學動物醫學院，動物疾病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130）

豬細小病毒病（PPI）會導致豬只繁殖功能障礙、消化和呼吸系統疾病，是由豬細小病毒（PPV）感染引起的。目前，細小病毒分為經典的豬細小病毒1 型（PPV1）以及近幾年陸續發現的2～7 型（PPV2～7）等新型細小病毒［1］。其中，PPV1、PPV2 和PPV3 在我國廣泛分布，且常與其他病原混合感染，對我國養殖業危害極大。豬細小病毒感染常發于初產母豬，表現為流產、木乃伊胎以及病弱胎，而母豬本身并無明顯癥狀［2］。仔豬感染后可導致生長受阻，同時還會造成炎癥疾病［3］。豬細小病毒具有很強的傳染性，既可通過生育垂直傳播，也可通過口鼻水平傳播，一旦病毒傳入，幾個月內便可感染所有健康豬群，而感染后的豬可長時間帶毒排毒，難于控制，嚴重危害養豬業的正常發展。

四川省涼山州某規模化豬場的初產母豬出現流產、產弱仔和死胎的情況，據了解，該場曾有過細小病毒、圓環病毒2 型和藍耳病發病史。為探明發病原因，本試驗采集了病死豬病料進行實驗室診斷。

1 材料與方法

1.1 病料來源 病料采集于四川省涼山州某規模化豬場死胎仔豬的心包積液、新鮮肺臟、肝臟及淋巴結。

1.2 試劑 TSA 培養基，DL2000 DNA Marker，ddH2O，Trizol 細胞裂解液，PrimeScriptTMRT Reagent Kit 反轉錄試劑盒，2×Taq MasterMix，通用型基因組DNA提取試劑盒。

1.3 細菌學檢測 在超凈臺內用接種環無菌蘸取死胎仔豬的心包積液、肝臟組織病料接種于TSA 培養基上，于37 ℃恒溫培養箱中培養，隔天觀察菌落生長情況。

1.4 病毒檢測

1.4.1 引物設計及合成 根據GenBank 已登錄的PRRSV、PCV2、PPV1、PPV2、PPV3 的基因序列，利用Oligo 7 軟件設計引物（表1）。

表1 引物信息

1.4.2 病料DNA/RNA的抽提及RNA的反轉錄 剖解仔豬，取淋巴結、肝臟、肺臟，加適量PBS 和鋼珠于EP 管中，放入冷凍型組織研磨器，于60 Hz 4 ℃研磨10 min，反復凍融3 次后離心取上清液（12 000 r/min，10 min）。利用通用型基因組DNA提取試劑盒進行病料DNA的抽提。采用Trizol法進行病料RNA的抽提。抽提完的病料RNA使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit 進行反轉錄，獲得病料的cDNA。

1.4.3 PCR 擴增檢測 50 μL 反應體系：2×Taq MasterMix 25 μL，上、下游引物各2 μL；DNA/cDNA 各1 μL，RNase-Free H2O 20 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環；72 ℃延伸5 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 細菌學檢查 經過37 ℃恒溫培養24 h 的平板無菌落生長，表明無細菌感染。

2.2 病毒檢測 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，PPV2和PPV3分別擴增出500 bp左右（見圖1）和200 bp 左右（見圖2）的目的條帶，與預期片段大小相符，而PCV2（見圖3）、PPV1（見圖4）和PRRSV（見圖5）并未擴增出任何條帶。陰性和陽性對照均成立。結合發病情況及PCR檢測結果，判斷該病例為PPV2和PPV3的混合感染。

圖1 PPV2 PCR檢測結果

圖2 PPV3 PCR檢測結果

圖3 PCV2 PCR檢測結果

圖4 PPV1 PCR檢測結果

圖5 PRRSV RT-PCR檢測結果

3 討論

細小病毒在自然界中普遍存在，侵染宿主范圍廣泛，涉及脊椎動物、無脊椎動物及人類。目前為止，能感染豬的細小病毒共有7 種，即豬細小病毒1～7 型。其中，PPV1 造成的危害最為嚴重，是豬場管理中重點防范的病原之一，而其余分型卻較少關注。有文獻指出，PPV2 和PPV3 在我國的流行程度不亞于PPV1，這提示我們廣泛的PPV2 和PPV3 感染可能會對養豬業造成潛在的危害［4］。

豬細小病毒于世界各地分布，給養豬業造成了極大損失。目前尚無針對豬細小病毒的特效抗病毒藥物，對豬細小病毒的控制也主要以預防為主。便捷、靈敏、特異的檢測方法能幫助豬場更好地控制豬細小病毒的傳播。PCR 技術自提出已經過幾十年快速發展，并衍生出了實時熒光定量PCR、原位PCR、RT-RAA 等技術。但傳統的PCR 技術仍是目前獸醫診斷的基礎技術，并廣泛用于各種疾病的基礎診斷。針對不同疾病設計出特異性引物，結合自動核酸提取儀，可在2 h內完成全部檢測，且具有較高的特異性和靈敏性。

本案例中，我們首先了解到該豬場的發病情況主要為母豬流產、產死胎，并且該場曾有過細小病毒、藍耳病毒和圓環病毒發病史，于是我們推斷此次發病可能是該豬場消毒未到位而導致的病毒感染。通過細菌檢測，結果也證實了并不是細菌導致的流產。PCR結果顯示，該豬場發病為PPV2 及PPV3 混合感染導致的。豬細小病毒主要引起母豬的繁殖障礙多發于8～10 月，患病母豬多無臨床癥狀，難以提前治療。有研究指出，PPV2 常與PCV2 混合感染，導致豬只出現豬呼吸道病復合體，最后因肺炎而死亡［5］。制定科學的免疫計劃，做好定期消毒工作，減少病毒的繼發感染，阻斷病原微生物的感染與傳播，是保障豬場正常運轉的根本措施。■